[0061] 1.3标本的采集 所有小鼠末次给药后禁食禁水24h，称体重后，眼球取血致死，分别取肝脏和脾脏等，将 眼球血离心，分离得到血清，与各脏器均置于-20°C冰箱中保存备用。制备脾细胞悬浮液后 采用流式细胞仪进行检测。
[0062] 1. 4评价指标 1. 4. 1保肝效果：比较分析对照组、抗结核药物组、多糖低剂量组、多糖中剂量组、多糖 高剂量组以及抗结核药+多糖组小鼠肝指数、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶（AST)、碱性磷 酸酶(AKP)、肝匀浆丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶（S0D)、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx)活性。
[0063] 1.4. 2细胞免疫因子：比较分析各组小鼠血清中白介素1 (IL-1)，白介素2 (IL-2)，白介素10 (IL-10)，免疫球蛋白G(IgG)，干扰素y(INF-y)，肿瘤坏死因子 a(TNF-a)含量，以及脾细胞中T淋巴细胞亚群⑶3,⑶4,⑶8,⑶4/⑶8等指标。
[0064] 1. 5统计学分析 采用SPSS16. 0统计学软件，所得数据进行统计学分析，其中计量资料显著性比较采用 啦验分析，计数资料显著性比较采用x2检验分析，以尸〈0.05作为差异有显著性。
[0065] 2?研究结果 2. 1各组实验性结核小鼠保肝效果的比较与空白对照组相比，模型组、抗结核药物组、 多糖低剂量组肝指数、ALT、AST、ASP、MDA显著升高，S0D和GPx显著下降，差异均具有统计 学意义（尸〈0.05-0.01)。与模型组相比，多糖高剂量组、多糖中剂量组、抗结核药+多糖 组肝指数、ALT、AST、ASP、MDA显著降低，S0D和GPx显著升高，差异均具有统计学意义（尸 〈0. 05-0. 01)。结果见表1。由此可见，多糖中剂量组对实验性结核小鼠的保肝效果最好，抗 结核药+多糖组效果次之。
[0066] 表1各组实验性结核小鼠保肝效果的比较（n=10)
注：与空白组相比，$表示尸< 0. 05,w表示尸< 0. 01 ;与模型组相比，#表示尸< 0. 05， ##表示尸< 0. 01。
[0067] 2. 2各组实验性结核小鼠细胞免疫因子水平的比较 2. 2. 1各组实验性结核小鼠血清细胞免疫因子水平的比较 与对照组相比，模型组、抗结核药物组、多糖高剂量组、多糖中剂量组、多糖低剂量组和 抗结核药+多糖组IL-1和TNF-a显著升高，模型组、抗结核药物组和多糖低剂量组IL-2、 IL-10、IgG和INF-y显著降低，差异均具有统计学意义（尸〈0. 05-0. 01)。与模型组相比， 多糖高剂量组、多糖中剂量组、抗结核药+多糖组IL-1和TNF-a显著降低，IL-2、IL-10、 IgG和INF-y显著提高，差异均具有统计学意义（尸〈0.05-0. 01)。结果见表2。
[0068] 表2各组实验性结核小鼠血清细胞免疫因子水平的比较（n=10)
注：与空白组相比，$表示尸< 0. 05,w表示尸< 0. 01 ;与模型组相比，#表示尸< 0. 05， ##表示尸< 0. 01。
[0069] 2. 2. 2各组实验性结核小鼠脾细胞T淋巴亚群免疫水平的比较 与对照组相比，模型组和抗结核药物组⑶3、⑶4和⑶4/⑶8明显降低，⑶8明显提高， 差异均具有统计学意义（尸〈0.01)。与模型组相比，多糖高剂量组、多糖中剂量组、多糖低剂 量组和抗结核药+多糖组⑶3、⑶4和⑶4/⑶8明显提高，⑶8明显降低，差异均具有统计学 意义（尸〈0? 05-0. 01)。
[0070] 表3各组实验性结核小鼠脾细胞T淋巴亚群免疫水平的比较（n=10)
注：与空白组相比，$表示尸< 0. 05,w表示尸< 0. 01 ;与模型组相比，#表示尸< 0. 05， ##表示尸< 0. 01。
[0071] 以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无 需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术 人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的 技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
【主权项】
1. 刺五加多糖的工业化生产方法，其特征在于，其采用下述工艺步骤： (1) 预处理：选取刺五加的根及根茎部分，粉碎后得到刺五加粉料，备用； (2) 除杂：所述刺五加粉料通过超临界萃取，去除小分子杂质，得到刺五加萃余物； (3) 提取：所述刺五加萃余物用等质量的水浸泡，水中添加原料质量0. 01-0. 05%的混 合酶； 然后用水进行连续逆流萃取，得到萃取液；所述的萃取条件为：料液质量比1:16~20， 萃取温度68~86°C，萃取时间2~4h ; (4) 吸附：所述萃取液粗过滤除杂后，经非极性或弱极性大孔树脂吸附，然后依次用 1~2BV的水和1~3BV低度醇洗脱，得到水洗液以及低度醇洗脱液两部分；所述水洗液通 过0. 22 y m的滤膜过滤得到透过液，将透过液通过0. 01 y m的滤膜，得到截留液；所述截留 液、低度醇洗脱液分别浓缩至固含量15-30%，得截留浓缩液、刺五加低度醇浓缩液； (5) 干燥：所述刺五加低度醇浓缩液干燥，得到刺五加苷E ;所述截留浓缩液干燥，得到 刺五加多糖。2. 根据权利要求1所述的刺五加多糖的工业化生产方法，其特征在于：所述步骤（2) 中的超临界萃取条件为OV流量1200~1400L/h、萃取压力20~28MPa、萃取温度43~ 65°C、萃取时间0? 5~3h，分离压力7~llMPa、分离温度22~37°C、分离时间0? 5~3h。3. 根据权利要求1所述的刺五加多糖的工业化生产方法，其特征在于：所述步骤（1) 中的粉碎指20目筛通过率90%以上、80目筛通过率10%以下；刺五加的根及根茎的含水量 在 8-16wt%。4. 根据权利要求1所述的刺五加多糖的工业化生产方法，其特征在于：所述步骤（3) 中刺五加萃余物浸泡温度20~35°C，时间2~4h ;所述混合酶中各组分比例为蛋白酶：纤 维素酶：果胶酶=2~4:1~2:0~0. 5。5. 根据权利要求1所述的刺五加多糖的工业化生产方法，其特征在于：所述步骤（3) 中连续逆流萃取用水pH值为4~7,料液质量比为1:16~18，萃取温度72~81°C。6. 根据权利要求1所述的刺五加多糖的工业化生产方法，其特征在于：所述步骤（4)中 的粗过滤是指萃取液降温后加入萃取液重量〇. 5~3%的硅藻土或珍珠岩，搅拌均匀后，将 萃取液通过300~500目的板式过滤机过滤，得到澄清透明的萃取液。7. 根据权利要求1所述的刺五加多糖的工业化生产方法，其特征在于：所述步骤（4) 中的树脂为D130、DlOl和AB-8中的一种或几种；低度醇为浓度5~10wt%的乙醇溶液。8. 根据权利要求1 _7所述的任意刺五加多糖的工业化生产方法，其特征在于：所述步 骤（5)中干燥方法为喷雾干燥或冷冻干燥中的任意一种。9. 根据权利要求1 _7所述的任意刺五加多糖的工业化生产方法，其特征在于：所述 刺五加多糖平均分子量为10~30KD ;阿拉伯糖：木糖：葡萄糖：甘露糖=6~9: 20~25: 6 ~9: 0? 5 ~2〇10. 权利要求1所述刺五加多糖的应用，其特征在于，刺五加多糖用于制备治疗结核病 药物方面的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种刺五加多糖的工业化生产方法及其应用，具体方法为：选取刺五加的根及根茎部分，粉碎后得到刺五加粉料，通过超临界萃取，得刺五加萃余物；加水进行连续逆流萃取，得到萃取液；经非极性或弱极性大孔树脂吸附，低度醇洗脱，水洗液过滤、浓缩干燥得刺五加多糖，低度醇洗脱液浓缩干燥刺五加苷E。本发明采用超临界二氧化碳对刺五加原料进行除杂，减轻了后续树脂吸附过程的压力；在提取刺五加多糖的同时，提取刺五加苷E，实现了原料的综合利用，刺五加苷E总提取率达到90%以上，多糖含量得率95%以上；本发明得到的刺五加多糖在治疗结核病方面有显著的疗效。
【IPC分类】C08B37/00, A61K31/715, A61P31/06
【公开号】CN105131142
【申请号】CN201510610184
【发明人】潘景芝, 孟庆龙, 刘雅静, 陈丽, 任跃英, 崔文玉, 张健
【申请人】长春市传染病医院
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年9月23日