食管癌中hsa-mir-612的检测引物组及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[OOOU 本发明设及基因检测技术领域，具体设及人类hsa-mir-612基因扩增的检测引物 组及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 食管癌是常见的一种消化道恶性肿瘤，在世界恶性肿瘤中居第6位，全世界每年 约有30万人死于食管癌。我国是世界上食管癌高发国家之一，每年平均病死约15万人。根 据1990-1992年中国恶性肿瘤死因回顾调查结果，我国食管癌的死亡率为17. 38/10万，占 癌症死亡率的16. 05%，位于恶性肿瘤死亡率的第四位。食管癌的发病率随着年龄增长而升 高，W50~70岁年龄段最为高发，大部分患者的确诊年龄超过60岁。近年来，虽然对食管 癌的治疗取得了一些进展，但鉴于其早期症状的隐蔽性和非特异性，临床上得到诊治的多 数已经是中、晚期患者。早期食管癌与中、晚期食管癌的预后有着很大的差别，早期食管癌 综合治疗5年生存率高达90% -100%，而中晚期患者5年生存率低于10%。随着研究的深 入，食管癌的早期诊断有了较大的发展。最近的大量研究发现，microRNA(mirNA)表达水平 的改变与食管癌的发生发展、诊断、治疗和预后密切相关。
[0003]miRNA是一类广泛存在于真核生物中，由大约22个核巧酸组成的非编码小分子RNA，Ma1:ure-mirNA在RNA-InducedSilencingComplex(RISC)的引导下同mRNA的特异序 列结合，从而导致mRNA降解或翻译抑制；研究表明miRNA在生物体的生长发育及分化过程 中起有重要的调控意义，在不同的发育时期及不同组织中mirNA也有不同的表达模式。据 报道，超过50%的miRNA编码基因位于与肿瘤或在复制过程中不稳定的脆性位点相关的基 因区间，提示miRNA与肿瘤的发生、发展密切相关。据报道，hsa-mir-612与食管癌的发生、 发展具有密切关系。在转移性食管癌中hsa-mir-612的表达量明显上调，可能是食管癌发 生淋己结转移调控中的关键分子，是食管癌早期诊断及转移相关的分子标志物。有望成为 临床食管癌转移有效的诊断及干预分子祀点。
[0004] 可用于分析小分子RNA检测方法主要有微阵列、Nodhern Blot等基于分子杂交 的方法，W及实时巧光定量PCR技术。基于分子杂交的方法敏感度低、耗时长、RNA的用量 较大；实时巧光定量PCR技术是在PCR反应体系中添加巧光物质或含巧光基团的探针，利用 巧光信号的积累实时监控整个PCR的过程，W达到对未知样品中检测因子的定性或定量分 析的目的。 阳〇化]但目前还没用于食管癌转移特征性的miRNA检测试剂盒。
[0006] 有鉴于此，特提出本发明。
【发明内容】
[0007] 本发明提供一种检测食管癌中hsa-mir-612基因的引物组；
[0008] 本发明提供一种检测食管癌中hsa-mir-612的试剂盒；
[0009] 为解决上述技术问题，本发明采用技术方案的基本构思是：检测hsa-mir-612基 因扩增的引物组，包括hsa-mir-612基因特异性引物组、内参U6基因特异性引物组；
[0010] 所述hsa-mi;r-612基因特异性引物组包括：
[0011] 上游引物hsa-mir-612-F，如沈QIDNO: 1所示的核巧酸序列， 阳〇1引下游引物hsa-mir-612-R，如沈QIDN0:2所示的核巧酸序列；
[0013] 所述内参U6基因特异性引物组包括：
[0014] 上游引物U6-F，如沈QIDN0:3所示的核巧酸序列， 阳01引下游引物U6-R，如SEQ ID NO: 4所示的核巧酸序列。
[0016] 本发明中，定义"hsa-mi;r-612基因特异性引物"是指WmirBase中基因序列 (Accession:MI0003625)为模板，本发明所述的hsa-mi;r-612基因特异性引物，经优化设计 能有效的避免pre-miRNA、pri-miRNA或其它小分子RNA的污染；
[0017] 作为本发明的优选方案，所述沈QIDNO:USEQIDNO: 2、SEQIDNO: 3和沈QID N0:4具有至多5个核巧酸差异的序列。
[0018] 本领域技术人员公知，引物上少数核巧酸残基的变化，尤其是引物在5'端出现的 少数核巧酸的改变，只能造成该核巧酸的错配，但不会造成整个DNA复制合成过程无法进 行，进而不会引起聚合酶链式反应产物产量的明显波动，因此，由上述SEQIDNO:USEQID N0:2、SEQIDN0:3和SEQIDN0:4具有至多5个核巧酸差异的序列也可W得到正确的足够 的聚合酶链式反应巧光信号，因此所述序列也应该包括在本发明中。
[0019] 作为本发明的优选方案，对所述hsa-mir-612基因特异性引物组、内参U6基因特 异性引物组进行硫化、甲基化、形成肤核酸、在核糖的2'位置引入甲基和/或氣取代基。
[0020] 检测hsa-mi;r-612基因扩增的试剂盒，包括W上所述的检测hsa-mi;r-612基因扩 增的引物组。
[0021] 作为本发明的优选方案，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品，所述阴性 质控品为&0,所述阳性质控品为体外合成的hsa-mi;r-612基因。
[0022] 作为本发明的优选方案，所述试剂盒还包括Premix,所述Premix包含DNA聚合酶、 SYBRGreenI、dNTPs及PCR反应缓冲液。
[002引作为本发明的优选方案，所述试剂盒分为阴性质控品、阳性质控品、hsa-mir-612 反应体系、内参U6反应体系；
[0024]所述hsa-mi;r-612 反应体系包括Premix10JiL浓度为 10JiM的hsa-mi;r-612-F0. 5JiL浓度为10JiM的hsa-mi;r-612-R0. 5JiL最后用无菌超纯水将反应体系补至 18.OyL; 阳0巧]所述内参U6反应体系包括Premix10yL浓度为10yM的U6-F0. 5yL浓度为 10yM的U6-R0. 5yL最后用无菌超纯水将反应体系补至18. 0yL。
[00%] 所述试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
[0027] 1)提取样本的核酸DNA ;
[0028] 2)取待检样本进行巧光定量PCR扩增反应；
[0029]扣根据扩增曲线Ct值，判断样品属性。
[0030] 作为本发明的优选方案，步骤2)中巧光定量PCR扩增反应的程序为95。IOmin; 95°C，15sec;60°C，lmin。
[0031] 采用上述技术方案后，本发明与现有技术相比具有W下有益效果：本发明通过设 计特异性扩增引物，对反应体系进行优化，实现各个成分在反应体系内的最佳浓度配比，最 大程度的实现了巧光聚合酶链式反应技术的高灵敏性，高特异性等特点，操作简捷，单个反 应从样品处理只需1. 5-2小时，适合大规模样本的处理，同时结果稳定，重复性好。
【附图说明】 阳0巧图1是hsa-hsa-mir-612基因检测试剂盒灵敏度测试图； 阳〇3引图2是hsa-hsa-mi;r-612基因检测试剂盒灵敏度测试图；
【具体实施方式】
[0034] W下结合具体实施例和附图对本发明做进一步解释说明，本发明所采用的试剂均 为市售。 阳0对 实施例1:
[0036] 用本发明所述的试剂盒检测食管癌中hsa-hsa-mi;r-612
[0037] 1)引物的设计：针对hsa-mir-612和U6基因序列设计特异性引物。序列分别如 下：
[0038] hsa-mir-ei2特异性引物：
[0039] hsa-mir-612-F :5'GCTGGGCAGGGCTTCT3,（沈Q ID N0:1)
[0040] hsa-