mir-612-R :5, CAGTGCGTGTCGTGGAGT3'（沈Q ID N0:2)
[0041] U6特异性引物：
[0042] U6-F :5, GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT3'（SEQ ID N0:3)
[0043] U6-R :5, CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT3'（沈Q ID N0:4)
[0044] 2)hsa-mi;r-612聚合酶链式反应液的配制 W45] 将各成分（引物和Premix)按一定比例混合在一起。单个反应的聚合酶链式反应 液包括？的111；[又10111^，113日-111；[1-612-尸（10111)0.5 111^，113日-111；[1-612-尺（10111)0.5 111^，最后 用无菌超纯水将反应体系补至18. 0yL。
[0046] 3) U6聚合酶链式反应液的配制
[0047] 将各成分（引物和Premix)按一定比例混合在一起。单个反应的聚合酶链式反应 液包括Premix10yL浓度为10yM的U6-F0. 5yL浓度为10yM的U6-R0. 5yL最后用 无菌超纯水将反应体系补至18. 0yL。 W4引 4)检测反应
[0049]取hsa-mir-612聚合酶链式反应液18. 0 y L加入2. 0 y L待检模板。取U6聚合酶 链式反应液IS.OiiL加入2.0yL待检模板。每批次反应均设置阴性质控化2〇)和阳性质 控（体外合成的hsa-mir-612基因）。采用CFX-96巧光定量PCR仪。反应条件如下：
阳化0]
[0051]
[0052] 5)结果判断
[0053] qPCR反应结束后，实验人员可W通过使用仪器的控制软件界面查看各基因的扩增 状况。在一般情况下，一个良好的qPCR实验，其内参基因U6的表达量相对都比较高，反映 到扩增曲线上，其扩增曲线呈"S"型，并且Ct或Cp值约为20或20W下。同时实验人员也 可W通过软件界面查看各基因的融解曲线情况，来判断其是否为特异性扩增，理论上，如融 解分析曲线呈"单峰"状态，即为特异性扩增。
[0054] 如果检测通道没有出现S型扩增曲线，判为hsa-mir-612基因阴性；如果检测通道 出现S型扩增曲线，且Ct值> 35. 0,判为hsa-mir-612基因阴性；如果检测通道出现S型 扩增曲线，且Ct值《35. 0,判为hsa-mi;r-612基因阳性。 阳05引 实施例2 :
[0056] 检测食管癌中hsa-hsa-mi;r-612试剂盒的灵敏度评价
[0057] 通过紫外分光光度法测定hsa-mi;r-612基因（体外合成，序列来源于miRBase， Accession:MI0003625/MIMAT0003280)浓度（copies/mL)，然后对其进行 10 倍梯度稀 释，稀释后的浓度分别为 2000000copies/test、200000copies/test、20000copies/test、 2000copies/test、200copies/test、20copies/test、2copies/test，及NTC，然后利用本发 明所述试剂盒进行检测，从图1可W看出，所述试剂盒的最低检测限《20copies/mL。
[0058]然后将浓度2000copies/test、200copies/test、20copies/test及NTC分别重复 5次，结果如图2所示。
[0059] 由此可见，本发明所述试剂盒性能完全与文中相关描述吻合，可W特异、敏感地检 测Jhsa-hsa-mi;r-612 基因。
[0060] W上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可W做出若干改进和润饰，运些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 食管癌中hsa-mir-612的检测引物组，其特征在于，包括hsa-mir-612基因特异性引 物组、内参U6基因特异性引物组； 所述hsa-mir-612基因特异性引物组包括： 上游引物hsa-mir-612-F，如SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列， 下游引物118&11化-612-1?，如3￡〇10勵:2所示的核苷酸序列 ； 所述内参U6基因特异性引物组包括： 上游引物U6-F，如SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列， 下游引物U6-R，如SEQ ID NO: 4所示的核苷酸序列。2. 如权利要求1所述的检测hsa-mir-612的检测引物组，其特征在于，所述SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4具有至多5个核苷酸差异的序列。3. 如权利要求2所述的检测hsa-mir-612的检测引物组，其特征在于，对所述 hsa-mir-612基因特异性引物组、内参U6基因特异性引物组进行硫化、甲基化、形成肽核 酸、在核糖的2'位置引入甲基和/或氟取代基。4. 检测hsa-mir-612基因扩增的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-3任意一所述的 检测hsa-mir-612基因扩增的引物组。5. 如权利要求4所述的检测hsa-mir-612基因扩增的试剂盒，其特征在于，还包括阴性 质控品和阳性质控品，所述阴性质控品为H 20,所述阳性质控品为体外合成的hsa-mir-612 基因。6. 如权利要求4所述的检测hsa-mir-612基因扩增的试剂盒，其特征在于，还包括 Premix，所述Premix包含DNA聚合酶、SYBR Green I、dNTPs及PCR反应缓冲液。7. 如权利要求6所述的检测hsa-mir-612基因扩增的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒 分为阴性质控品、阳性质控品、hsa-mir-612反应体系、内参U6反应体系； 所述hsa-mir-612反应体系包括Premix IOy L，浓度为IOyM的 hsa-mir-612-FO. 5 y L，浓度为10 y M的hsa-mir-612-R 0. 5 y L，最后用无菌超纯水将反应 体系补至18. OyL ; 所述内参U6反应体系包括Premix IOy L，浓度为IOy M的U6-F 0.5 yL，浓度为IOy M 的U6-R 0. 5 y L，最后用无菌超纯水将反应体系补至18. 0 y L。8. 权利要求4-7任意一项所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤： 1) 提取样本的核酸DNA ; 2) 取待检样本进行荧光定量PCR扩增反应； 3) 根据扩增曲线Ct值，判断样品属性。9. 如权利要求8所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤2)中荧光定量PCR扩增 反应的程序为 95°C，IOmin ;95°C，15sec ;60°C，Imin0
【专利摘要】本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及人类hsa-mir-612基因扩增的检测引物组及试剂盒。检测hsa-mir-612基因扩增的引物组，包括hsa-mir-612基因特异性引物组、内参U6基因特异性引物组。所述试剂盒包括hsa-mir-612基因特异性引物组、内参U6基因特异性引物组、阴性质控品、阳性质控品、Premix。本发明通过设计特异性扩增引物，对反应体系进行优化，实现各个成分在反应体系内的最佳浓度配比，最大程度的实现了荧光聚合酶链式反应技术的高灵敏性，高特异性等特点，操作简捷，单个反应从样品处理只需1.5-2小时，适合大规模样本的处理，同时结果稳定，重复性好。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105154537
【申请号】CN201510521105
【发明人】孙艳玲, 郝武会, 李彦格
【申请人】北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司
【公开日】2015年12月16日
【申请日】2015年8月24日