一种军团菌快速检测与分型的引物及方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物分子检测领域，尤其设及一种军团菌快速检测与分型的引物及 方法。
【背景技术】
[0002] 军团菌是一种胞内寄生的革兰阴性杆菌，在±壤和水系统中广泛存在。目前军团 菌属有52种包括70多个血清型，并不断有新的菌种从环境中分离。近年来发现，约有一半 的军团菌种与人类疾病有关，其中80%W上的军团菌感染是由嗜肺军团菌引起。军团菌通 过空气W气溶胶的形式感染人，引起军团菌性肺炎，严重威胁人类的健康。因此，建立一种 能检测军团菌和快速鉴别嗜肺军团菌与非嗜肺军团菌的方法具有重要的临床意义。
[0003]目前对军团菌的检测鉴定方法主要有血清抗体检测、尿可溶性抗原检测、军团菌 分离培养等。但是上述的检测方法存在检测时间长、阳性率低、培养基的配置复杂和价格昂 贵的缺陷，不利于军团菌的快速检测。近年来，分子生物学的发展为微生物的分类鉴定工作 提供了较简便和准确的方法。PCR方法具有很高的特异性与敏感性，其主要是通过检测军 团菌中的特异基因，W达到快速检测军团菌的目的。
[0004] 中国专利申请201410607389. 6公开了一种快速区分非嗜肺、嗜肺与嗜肺I型军团 菌的S重PCR检测方法，所述检测方法主要是针对军团菌种属、嗜肺军团菌种和嗜肺军团 菌I型的leSrRNA、danl和0RF9S个基因的引物，对dNTPs和引物浓度比例W及退火溫度 进行优化，建立快速区分非嗜肺、嗜肺与嗜肺I型军团菌的S重PCR方法，该检测方法可W 对分离培养到的可疑军团菌菌株进行快速有效的判定。但是，该检测方法只对可疑军团菌 菌株进行分型，而且是利用了=个基因祀点，检测范围较狭窄，特异性不强，不利于该检测 方法的推广和应用。
[0005] 中国专利CN101717815B公开了一种军团菌快速检测与分型方法，该方法是W基 因组DNA为模板进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳分析，对检测出阳性PCR产物进行酶切 反应，对酶切反应产物作琼脂糖凝胶电泳分析进行分子分型。该检测方法能够检测出军团 菌，且能将其分子分型为嗜肺军团菌或非嗜肺军团菌。但是，该检测方法的军团菌分型需要 进行多次琼脂糖凝胶电泳分析，操作比较繁琐，大大限制了该检测方法的应用。
【发明内容】
[0006] 为解决现有技术中军团菌的检测方法存在检测范围窄、操作繁琐的缺陷，本发明 提供一种军团菌快速检测与分型的引物及方法，W解决上述问题。
[0007] 本发明提供一种军团菌快速检测与分型的引物，其包括军团菌属特异引物和嗜肺 军团菌16srRNA基因单核巧酸多态性位点特异引物，所述军团菌属特异引物为： GL261F:5, -GGAGGGTTGATAGGTTAAGAGC-3,（SEQIDNO. 1)， GL261R:5, -CGATCTCTACGCATTTCACCG-3'(SEQIDNO. 2); 所述嗜肺军团菌16srRNA基因单核巧酸多态性位点特异引物为： LP-A62Sr:5，-GTCAACCAGTATTATCTGACCGT-3,（SEQIDNO. 3)， LP-C629f:5' -CTGGGCTTMCCTGGGAC-3'(沈QIDNO. 4)。
[0008] 进一步地，所述军团菌属特异引物与嗜肺军团菌16srRNA基因单核巧酸多态性位 点特异引物的浓度比为1-3 :1-3,所述军团菌属特异引物与嗜肺军团菌16srRNA基因单核 巧酸多态性位点特异引物的浓度比优选为2 :1。
[0009] 进一步地，所述军团菌属特异引物和嗜肺军团菌16srRNA基因单核巧酸多态性位 点特异引物的祀基因为16SrRNA基因。
[0010] 另外，本发明还提供了一种军团菌快速检测与分型的方法，包括如下步骤： Sl应用细菌基因组DNA提取液提取待测标本中的细菌基因组DNA; S2W细菌基因组DNA为模板，采用权利要求1所述的军团菌属特异引物和嗜肺军团菌 16srRNA基因单核巧酸多态性位点特异引物进行PCR扩增； S3将阳性对照和阴性对照进行PCR扩增； S4将所得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。
[0011] 进一步地，所述步骤Sl中细菌基因组DNA提取液的配方为：化elex100resin 5〇/〇;化13-肥11〇1111，口册.3;乙二胺四乙酸二钢0.11111;叠氮钢0.1%;蛋白酶1( 200 ^邑/ mlO
[0012] 进一步地，所述步骤S2中的PCR扩增反应条件包括：阶段I:94°C3min;阶段2 : 94°C20s;阶段3:59°C20s;阶段4:72°C25s;35个循环；阶段5:72°C5min;在4°C保溫。
[0013] 进一步地，所述步骤S2中军团菌属特异引物扩增序列为26化p。其中， 化261F-GL261R引物对扩增序列为军团菌属16SrDNA基因一段保守序列，具体序列如下： GGAGGGTTGATAGGTTAAGAGCTGATTAACTGGACGTTACCCACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCC AGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGGGTGCGTAGGTGGTTGATTA AGTTATCTGTGAAATTCCTGGGCTTAACCTGGGACGGTCAGATAATACTGGTTGACTCGAGTATGGGAGAGGGTAGT GGAATTTCCGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCG。
[0014] 进一步地，所述步骤S2中肺军团菌16srRNA基因单核巧酸多态性位点特异引物 分别与军团菌属特异引物配对扩增26化P内的一段序列；化261F- (LP-A628R)引物对扩增 片段为203bp; (LP-C629F) -GL261R引物对扩增序列为97bp。其中，化261F- (LP-A628R)引 物对扩增片段亦为军团菌属16SrDNA基因一段保守序列为上述26化P片段内的一段203bp 序列，具体序列如下： GGAGGGTTGATAGGTTAAGAGCTGATTAACTGGACGTTACCCACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCC AGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGGGTGCGTAGGTGGTTGATTA AGTTATCTGTGAAATTCCTGGGCTTAACCTGGGACGGTCAGATAATACTGGTTGAC； (LP-C629F)-GL261R引物对扩增序列亦为军团菌属16SrDNA基因一段保守序列为上述 261BP片段内的一段97bp序列，具体序列如下： CTGGGCTTAACCTGGGACGGTCAGATAATACTGGTTGACTCGAGTATGGGAGAGGGTAGTGGAATTTCCGGTG TAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCG〇
[0015] 进一步地，所述步骤S3中阳性对照包含嗜肺军团菌基因组DNA、军团菌属特异引 物和嗜肺军团菌16srRNA基因单核巧酸多态性位点特异引物，所述军团菌基因组DNA核巧 酸序列在NCBI基因库上编号为NR_074231。
[0016] 更进一步地，所述步骤S3中阴性对照包含军团菌属特异引物和嗜肺军团菌16s rRNA基因单核巧酸多态性位点特异引物。
[0017] 本发明提供的军团菌快速检测与分型的方法是利用等位基因特异性PCR原理，利 用等位基因上一两个碱基的差异，特异扩增其中一个等位基因的技术。其主要原理是利用 一对特异与其中一条等位基因完全互补的引物，而与另外一条等位基因在3'端不互补的引 物进行基因扩增，从而达到鉴别的效果。发明人经过生物信息学方法的研究发现军团菌属 16srRNA基因里有一段保守序列中存在两个单核甘酸多态性位点（SNP)，该位点在嗜肺军 团菌中为A62SC629,而在非嗜肺军团菌中的单核甘酸多态性位点（SNP)贝怀是A62SC629,因此利 用一对军团菌属特异引物和一对肺军团菌16srRNA基因单核巧酸多态性位点特异引物做 多重PCR可W快速检测军团菌属，同时还可W鉴别出军团菌是嗜肺军团菌还是非嗜肺军团 -tt： 园O
[0018] 本发明提供的军团菌快速检测与分型方法的结果判定方法是：对PCR产物的琼 脂糖凝胶电泳结果进行分析，若出现261bp条带，则说明检测标本中含有军团菌属细菌，反 么则说明检测标本中不含军团菌属细菌；若除了出现26化P条带外还同时出现了 203bp和 97bp条带，则说明检出的军团菌为嗜肺军团菌，若除了 261bp条带，没有同时出现203bp和 97bp条带，则说明检测到的军团菌为非嗜肺军团菌。
[0019] 本发明提供军团菌快速检测与分型的方法不仅能在临床中应用，还可W应用于环 境水标本中，为环境水源风险性控制及军团菌感染流行病学调查提供依据和工具，有利于 该检测方法的推广和应用。
[0020] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供的军团菌快速检测与分型的 引物具有特异性好和准确性高的优点，提高了检测效率。此外，本发明还提供军团菌快速检 测与分型的方法，通过使用本发明提供的特异性的引物，可W快速、简便的检测出军团菌， 同时还可W进一步分型为嗜肺军团菌和非嗜肺军团菌，该检测方法无需进行多次凝胶电泳 分析，操作简便，而且检测结果准确，是一种理想的军团菌快速检测与分型的方法。
【附图说明】
[0021] 图1为PCR扩增产物的凝胶电泳图；其中：Marker条带；从下到上分别为：100bp、 200bp、300bp、400bp、500bp和600bp，1-4分别为各个不同的菌种鉴定结果，PC为阳性对 照，NC为阴性对照。
【具体实施方式】
[0022] W上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定 本发明的具体实施只局限于运些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在 不脱离本发明构思的前提下，还可W做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的 保护范围。其中，Qielex100resin购买自bio-rad公司（货号：1432832)。
[002引实施例1、引物 本发明提供一种军团菌快速检测与分型的引物。
[0024]表1本发明提供的引物
实施例2、引物的配对及其扩增片