陆地棉特异性pcr引物对及其在植食性昆虫体内的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及分子生物学检测技术，具体地说，设及陆地棉特异性PCR引物对及其 在植食性昆虫体内的检测方法。
【背景技术】
[0002] 陆地棉（GossypiumhirsutumL)，属锦葵科，一年生草本，是一种用途很广的天 然纺织纤维，是我国重要的经济作物。
[0003] 我国每年因棉花遭受虫害损失严重，而昆虫与植物间的关系一直是研究的热点。 昆虫对植物的取食W及昆虫在植物间的转移扩散方面的研究，传统方法还是通过昆虫种群 数量的变化动态来间接反映，或通过解剖观察法，标记法等。但是运些方法都存在费时，费 力，花费较高，不易成功等缺陷。
[0004]PCR检测技术是通过特异序列扩增祀区域DNA，利用特异性的引物，根据预期DNA 条带的有无来判断检测结果，无需测序和序列比化具有灵敏度高、特异性强、快速、简便且 重现性和稳定性强等优点，为昆虫对植物的取食的定性与定量W及昆虫在植物间的转移扩 散分析提供了有效的技术手段。
【发明内容】
[000引本发明的目的是提供陆地棉特异性PCR引物对。
[0006] 本发明的另一目的是提供检测植食性昆虫体内微量陆地棉的方法。
[0007] 为了实现本发明目的，本发明提供的陆地棉特异性PCR引物对是根据GenBank中 公布的陆地棉rbcL序列（册901197. 1)设计的，所述引物对包括：
[0008]正向引物MraFl:5'-CGACATTGAGCCCGTTCCTG-3'（SeqIDNo. 1)
[0009]反向引物MraRl:5'-GCGACCATACTTGTTCAA-3'（SeqIDNo. 2)
[0010] 本发明还提供含有所述引物对的用于PCR检测陆地棉的试剂盒。
[0011] 优选地，所述试剂盒还包括2XPCRMasterMix。2XPCRMasterMix购自天根生化 科技（北京）有限公司（Tiangen公司），货号CW2347。
[001引更优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
[0013] 本发明还提供所述引物对或所述试剂盒在检测陆地棉中的应用。
[0014] 所述应用包括W下步骤：1)提取待测样品DNA;2)W步骤1)提取的DNA为模板， 利用引物化aFl和化aRl进行PCR扩增反应；3)分析PCR产物。
[0015] 本发明进一步提供检测植食性昆虫体内微量陆地棉的方法，包括W下步骤：1)用 CTAB法提取待测昆虫总DNA;2)W步骤1)提取的DNA为模板，利用引物化aFl和化aRl进 行PCR扩增反应；3)分析PCR产物。
[0016] 其中，PCR反应体系W20yL计为：
[0017] 1.5ng/阵模扳DNAI.O^iL 2XPCRMaskrMix 10|iL lO^Tiol/LSH^MraFl 0.4,liL 10 叫nol/L引物Mra民I 0.4|iL cWHzO 补足至.20.睐
[001引PCR反应条件为：95°C10分钟；95°C30秒，58°C30秒，72°C60秒，共40个循环； 72°C5分钟。
[0019] 步骤3)中采用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，陆地棉的扩增产物大小为 24 化P。
[0020] 本发明根据GenBank中公布的陆地棉rbcL序列（册901197. 1)设计一对特异性引 物，该引物特异性强，仅对陆地棉具有扩增能力，而对同域的其他物种无扩增产物。采用本 发明提供的方法和引物检测陆地棉，准确性高，操作简单、快速、高效，一般可在5个小时内 完成检测，且具有较高的灵敏度，质粒浓度检出限为4. 21E+04。通过对取食过陆地棉的绿盲 睹DNA进行扩增，检测率达到100%，证明了该方法的可行性。
【附图说明】
[002。 图1为本发明实施例1中陆地棉特异性引物化aFl/MraRl的PCR检测结果；其中，M:DNA分子量标准2000bpladder;1-94为表1，表2中序号所对应物种的扩增结果，-为阴 性对照。
[002引图2为本发明实施例2中陆地棉特异性引物化aFl/MraRl的质粒浓度梯度检测结 果；其中，M:DNA分子量标准2000bpladder;1-10为模板质粒浓度4. 21E+10依次10倍稀 释浓度梯度；-为阴性对照。
[002引图3为发明实施例3中陆地棉特异性引物化aFl/MraRl对取食了陆地棉的绿盲睹DNA的检测结果；其中，M:DNA分子量标准2000bpladder; 1-10为绿盲睹的扩增结果；+为 陆地棉DNA的检测结果，-为阴性对照。
【具体实施方式】
[0024]W下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明， 实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（SambrookJ&Russell DW,Molecularcloning:a1油oratorymanual, 2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。 [00巧]实施例1特异性引物化aFl/MraRl对陆地棉的扩增效果 [002引 1、陆地棉基因组DNA的制备
[0027] 将棉花叶片放入研鉢中将其磨碎，用DNAquickPlantSystem快捷型植物基因组 DNA提取试剂盒（非离屯、柱型）（Tiangen公司）提取陆地棉基因组。将DNA溶液储于-20°C备用，进行PCR扩增时吸取1yL溶液作为DNA模板。
[002引 2、合成检测陆地棉的特异性引物
[002引根据GenBank中公布的陆地棉rbcL序列触901197. 1)设计如下特异性PCR引物 对：
[0030]MraFl:5'-CGACATTGAGCCCGTTCCTG-3'（SeqIDNo.I)
[0031]MraRl:5'-GCGACCATACTTGTTCAA-3'（SeqIDNo. 2)
[0032] 3、PCR扩增
[0033] 反应体系20JiL:
[0034] 1.5ng/咕模扳D-NA 1.0 咕 2XPC民MasterMixIO^iL IOjimol/L引物MraFI 0.4|iL IOjimol/L引物Mra民I 0.4fiL ddH2〇 补足至20阵
[003引 PCR扩增程序：95°C预变性10分钟；95°C30秒，58°C30秒，72°C60秒，共40个循 环；最后72°C延伸5分钟。
[0036] 4、PCR产物鉴定
[0037] 取6 y L PCR扩增产物，用1%琼脂糖凝胶电泳分离，经漠化乙锭染色后，于凝胶成 像系统中，根据扩增产物的大小判定。
[003引 5、结果
[0039] 利用引物化aFl/MraRl，W陆地棉DNA为模板，W陆地棉同域的46种其他物种（见 表1、表2)为对照进行PCR扩增，结果如图1所示，1、2泳道对应的陆地棉扩增出了 24化P 的目的条带，说明根据陆地棉的rbcL序列设计的PCR扩增引物特异性强。回收上述24化P 的目的条带，进行测序，结果如SeqIDNo. 3所示。
[0040] 表1弓I物特异性检测中所设及的植物种类
[0041]
[0042]
[004引表2弓I物特异性检测中所设及的昆虫种类
[0044]
[004引实施例2引物化aFl/MraRl对陆地棉最低检出量的测定
[0046] 1、陆地棉模板基因组的制备，参照实施例1中步骤1操作。
[0047] 2)陆地棉质粒的制备
[0048] 按照实施例1中步骤3的方法对陆地棉基因组DNA进行扩增，扩增完毕后用1. 5% 琼脂糖凝胶电泳检测。利用Axygen琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒回收PCR产物，PCR产物经 胶回收后克隆于祀asy-T3载体上（按试剂盒说明操作），重组质粒转化Transl-Tl感受态 细胞，然后涂布于含有Ampicillin/X-gal/IPTG的LB平板上，37°C倒置培养15小时。经蓝 白斑筛选后，挑取10个阳性克隆在含Amp的LB液体培养基中培养过夜，次日用Axygen质 粒提取试剂盒提取质粒，所得质粒按10倍浓度进行梯度稀释，直至检测不出条带，取1yL 作为PCR扩增的模板，直接加到PCR反应体系中，反应体系同实施例1中步骤3的描述。
[0049] 利用引物化aFl/MraRl进行最低检出量的测定，W不同稀释倍数的陆地棉质粒浓 度进行PCR扩增，模板质粒浓度检出限（拷贝数）为4. 21E+04 (图2)。
[0050] 实施例3利用引物化aFl/MraRl对昆虫体内微量的陆地棉进行检测
[0051] 1、将10头绿盲睹饥饿处理24小时，用陆地棉叶子饲喂3小时后，立即用液氮冷冻 处死。
[005引 /2、将单头绿盲睹放在1. 5ml的离屯、管中研碎，用CTAB法提取DNA。
[0053] 在离屯、管中加入40yL的PBS(150mM化Cl, 150mMNA3PO4,抑7. 2,），随后加入 450yL的TES缓冲液（0.IMTris,P册，IOmM邸TA, 2%SD巧、IOyL的蛋白酶K(10mg/ml)和 IOmg的PVP，在金属浴58°C放置12h。从金属浴中取出后加入150yL的5M化Cl和65yL 的10%CTAB，将样品在金属浴65°C放置10分钟，取出后加入氯仿/异戊醇（24 :1)进行抽 提，静置后加入225yL的5MNHaAc,冰上放置30分钟W上，取出后12000g离屯、20分钟，弃 上清。向沉淀中加入异丙醇，沉淀过夜。12000g离屯、20分钟，弃上清，沉淀用70%的酒精 洗涂，惊干后，加入100yL的d地2〇溶解DNA。
[0054] 3、采用化aFl/MraRl按实施例1中步骤3的方法对绿盲睹DNA进行PCR扩增，10 头绿盲睹均检测到取食了陆地棉（图3)。
[0055] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可W对之作一些修改或改进，运对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的运些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 陆地棉特异性PCR引物对，其特征在于，所述引物对包括： 正向引物 MraFl :5' -CGACATTGAGCCCGTTCCTG-3' 反向引物 MraRl :5' -GCGACCATACTTGTTCAA-3'。2. 含有权利要求1所述引物对的用于PCR检测陆地棉的试剂盒。3. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括2 X PCR MasterMix。4. 根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。5. 权利要求1所述引物对或权利要求2-4任一项所述试剂盒在检测陆地棉中的应用。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括以下步骤： 1) 提取待测样品DNA ; 2) 以步骤1)提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的引物MraFl和MraRl进行PCR 扩增反应； 3) 分析PCR产物。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，PCR反应体系以20 μ L计为：8. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，PCR反应条件为：95°C 10分钟；95°C 30 秒，58°C 30秒，72°C 60秒，共40个循环；72°C 5分钟。9. 根据权利要求6-8任一项所述的应用，其特征在于，步骤3)中采用1 %琼脂糖凝胶 电泳检测PCR产物，陆地棉的扩增产物大小为247bp。10. 检测植食性昆虫体内微量陆地棉的方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 用CTAB法提取待测昆虫总DNA ; 2) 以步骤1)提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的引物MraFl和MraRl进行PCR 扩增反应； 3) 分析PCR产物； 其中，PCR反应体系以20 μ L计为：PCR反应条件为：95°C 10分钟；95°C 30秒，58°C 30秒，72°C 60秒，共40个循环；72°C 5 分钟。
【专利摘要】本发明提供陆地棉特异性PCR引物对，其是根据GenBank中公布的陆地棉rbcL序列(HQ901197.1)设计的一对特异性引物，该引物对特异性强，仅对陆地棉具有扩增能力，而对同域的其他物种无扩增产物。本发明还提供利用该引物对检测植食性昆虫体内微量陆地棉的方法。采用本发明提供的方法和引物检测陆地棉，准确性高，操作简单、快速、高效，一般可在5个小时内完成检测，且具有较高的灵敏度，质粒浓度检出限为4.21E+04。利用该引物对检测植食性昆虫，可以辨别昆虫是否对棉花进行了取食。本发明采用PCR技术，提高了检测准确性，节约了检测时间，适于基层推广应用。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105154539
【申请号】CN201510548229
【发明人】王倩, 杨帆, 陆宴辉, 杨益众
【申请人】中国农业科学院植物保护研究所
【公开日】2015年12月16日
【申请日】2015年8月31日