一种耐高温产聚羟基丁酸酯细菌的培养基的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术，具体是一种耐高温产聚羟基丁酸酯细菌(PHB)的培养基。
【背景技术】
[0002]聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxybutyrate，PHB)是一种细胞内聚酯，具有生物降解性，为生物可降解塑料的新型高分子材料。
[0003]目前PHB的生产方法有微生物合成和转基因植物合成；转基因植物合成PHB降低生产成本尚未成功；利用微生物合成PHB的生产成本相对较高，主要是由于高的发酵底物价格及提取纯化费用。
[0004]工业上主要采用两步法培养微生物(有氧/富氮和贫氧/贫氮)来获得PHB，控制氧含量的方法为单纯的氧浓度控制(主要是灌注纯氮)在成本、设备、工艺上要求很高。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是要提供一种耐高温、产聚羟基丁酸酯(PHB)多的细菌培养基。
[0006]本发明一种耐高温产聚羟基丁酸酯细菌的培养基，主要由下述按重量配比计的: 酵母浸粉10g/L
蛋白胨10g/L 牛肉浸粉5g/L 葡萄糖20g/L 硫酸铵5g/L
加蒸懼水定容至IL而成。
[0007]本发明的优点是:由于该耐高温产PHB细菌可以耐受60°C的高温，因而可以很方便地通过控制温度进而控制氧浓度，降低生产工艺和设备要求；可以在很简单的发酵设备(如无防杂菌污染装置)中，利用高有机质含量的蔗糖、木薯工业废水作为碳源生长和合成PHB,降低设备投入及发酵底物成本；还可以通过提高温度杀死其他非耐高温细菌，从而保证目标菌体单一性，并提高其生物量和所提取的PHB纯度。
【具体实施方式】
[0008]下面结合实施例对本发明作进一步的阐述，但不是对本
【发明内容】
的限定。
[0009]本发明一种耐高温产聚羟基丁酸酯细菌的培养基，主要由下述按重量配比计的: 酵母浸粉10g/L,蛋白胨10g/L,牛肉浸粉5g/L,葡萄糖20g/L,硫酸铵5g/L,加蒸懼水定容至IL而成。
[0010]应用实施例:
将本发明培养基应用于筛选耐高温产聚羟基丁酸酯细菌的方法，是:
(I)采集土壤样品:
采样区域:①北方(天津、山东)、②南方(广西、广东)。
[0011]土壤类型:果园、花园、菜园、田地、山丘、河边、居民区和工业区。
[0012]样地设置和采样:在各种土壤类型区域划定面积为100 HI2的正方形为样地，以对角线交叉点为圆心的一半对角线长度为半径画圆圈，圆圈与对角线交叉点为采样点。采集各点地表以下5 cm处土壤为样品，每份样品I千克，每个样地4份样品，共32份；
(2)样品预处理:
分别取10 g样品装入已灭菌并盛有90 mL无菌水的玻璃瓶中，将其编号并密封后，剧烈震摇10 min。静置悬浮液，待分层后取上层液体离心(4500 r/min，2 min)，取出离心后的上层菌液备用；
(3)扩大培养:分别取菌悬液10μ L接种于250 mL LB培养液中，置于37°C恒温箱培养震荡(100 r/min)培养72 h，获得扩大菌种培养液；
(4)逐级梯升温阶筛选:取10μ L扩大菌种培养液接种于250 mL LB培养液中，按温度逐级递升(37?— 400C^ 450C^ 500C^ 55°C^ 6(TC— 65°C^ 7(TC— 75°C^ 80。0 进行培养；其中，后一温阶所用接种菌液取自前一温阶培养的菌液，接种量为10μ L ;
(5)选定耐高温菌群:若在某培养温度下，接种菌液后的LB培养液出现浑浊，则可判定该菌可在此温度生长，反之则可排除此编号土壤样品；
(6)选定耐高温菌株:取耐50°C以上菌液以生理盐水稀释(106)并均匀涂布于富氮培养基内，37°C培养48 h ;挑取有不同外形特征的单菌落，于37°C富氮培养基上分别扩繁后，以完全营养液体培养基加20%甘油与_80°C保存；
(7)采用尼罗蓝染色法，分别接种耐50°C以上具不同形态特征的单菌落于LB培养基温度培养12 h ;耐高温菌株经适当扩繁后稀释(10 6)涂布筛选培养基，30°C条件下培养36 h后，在365 nm紫外灯照射下呈橘粉色菌落为产PHB菌株。目标菌株以富氮培养基37°C扩繁后，以完全营养液体培养基加20%甘油-80°C保存。
[0013]本耐热产PHB菌可以在30?60°C条件下，利用富氮培养基:酵母浸粉10g/L，蛋白胨10g/L，牛肉浸粉5g/L，葡萄糖20g/L，硫酸铵5g/L，加蒸馏水至1000 mL，进行扩繁。
[0014]经检测:与传统产PHB且最高耐受45°C的细菌相比，本耐热产PHB菌可耐受60°C尚温。
【主权项】
1.一种耐高温产聚羟基丁酸酯细菌的培养基，其特征是:主要由下述按重量配比计的: 酵母浸粉10g/L 蛋白胨10g/L 牛肉浸粉5g/L 葡萄糖20g/L 硫酸铵5g/L 加蒸懼水定容至IL而成。
【专利摘要】本发明公开了一种耐高温产聚羟基丁酸酯细菌的培养基，主要由下述按重量配比计的：酵母浸粉10g/L，蛋白胨10g/L，牛肉浸粉5g/L，葡萄糖20g/L，硫酸铵5g/L，加蒸馏水定容至1L而成。用这种培养基培养的细菌可以耐受60℃的高温，因而可以很方便地通过控制温度进而控制氧浓度，降低生产工艺和设备要求；可以在很简单的发酵设备中，利用高有机质含量的蔗糖、木薯工业废水作为碳源生长和合成PHB，降低设备投入及发酵底物成本；还可以通过提高温度杀死其他非耐高温细菌，从而保证目标菌体单一性，并提高其生物量和所提取的PHB纯度。
【IPC分类】C12N1/20
【公开号】CN105199977
【申请号】CN201410287495
【发明人】陆祖军
【申请人】陆祖军
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2014年6月25日