分泌表达β-葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母工业菌株及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程领域，设及一种分泌表达P-葡萄糖巧酶的重组酿酒酵母工 业菌株及应用。
【背景技术】
[0002] P-葡萄糖巧酶（P-glucosidase，EC3. 2. 1. 21)，是一种能催化糖基基团转移反 应的酶。它能水解多种P-葡萄糖巧键，具有底物广谱性，几乎存在于一切生物体内，有着 多方面的、重要的生理功能；同时在体外特定的条件下，它还能催化合成反应，如催化合成 烷基糖巧。因此，它在能源、医药、食品、化工等领域中有着重要的应用价值。
[0003] 能源领域是P-葡萄糖巧酶最为重要的一个应用领域，即木质纤维素原料降 解、生产生物燃料如乙醇、下醇等。P-葡萄糖巧酶作为纤维素酶系=类水解酶之一（另 两类为：外切葡聚糖酶，EC3. 2. 1. 91，cellobiosidase ;内切葡聚糖酶，EC 3. 2. 1. 4， glucanohy化olase)，负责进一步水解由外切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶作用得到的纤维寡 糖或纤维二糖为葡萄糖，同时解除纤维寡糖或纤维二糖积累对外切葡聚糖酶/内切葡聚 糖酶的抑制作用，因此，P-葡萄糖巧酶催化的水解反应是纤维素降解、进一步生产生物 燃料中的限速步骤（Sukumaran 服,Sin曲ania RR,Pandey A. 2005. Microbial cellula ses-Production, applications and challenges. Journal of Scientific&Industrial Research, 2005, 64(11) :832-844)。研究证明纤维素的充分、快速酶解需要前述=类组分 的合适配比，但纤维素酶生产菌株所产酶系一般都会欠缺P-葡萄糖巧酶。纤维素酶解 产醇早先相关的工艺路线是先糖化后发酵（S巧arate Hy化olysis and化rmentation， SHF),即先预处理木质纤维素，再用纤维素酶水解其中的纤维素组分产生单糖，然后用酵 母菌或其它微生物发酵产生乙醇、下醇等，其缺点是糖化步骤中积累的葡萄糖会反馈抑制 0 -葡萄糖巧酶水解纤维二糖，而纤维二糖的积累反过来又抑制外切葡聚糖酶和内切葡聚 糖酶的活性，导致纤维素降解的终止。运种工艺后来改进为同步糖化发酵（Simultaneous Saccharification and F'ermentation，SSF)，即纤维素酶对纤维素的水解和酵母菌或其它 微生物发酵在同一容器中进行，一边酶解产生糖，一边发酵转化成醇，其优点是减少了反应 器的个数降低了设备投资，同时避免了产物抑制问题。缺点是纤维素酶酶活低、生产成本高 的问题仍然存在，同时纤维素酶的作用溫度和常用发酵酵母菌或其它微生物的发酵溫度不 匹配。解决运些问题的方案之一是开发出能同时高效产生纤维素酶和高效发酵单糖产醇的 微生物（Breaking the Biological Barriers to Cellulosic Ethanol :A Joint Research Agenda. Repo;rt from the December 2005Workshop,D犯/SC-0095. U.S. Department of Energy Office of Science)。
[0004] 在医药领域，通过催化具有强有力的生物学活性的糖巧配基单元的释放和生产， P-葡萄糖巧酶可用于抗肿瘤试剂的生产；在食品领域，能催化大豆中的抗癌成份大豆异 黄酬（如genistein、dia化ein等）使其从不易为人体吸收的结合型糖巧转化为易为人体 吸收的游离型巧元；在化工领域，能催化醇和糖合成烷基糖巧（一类新型具有阴离子性质 的非离子表面活性剂）。 阳〇化]鉴于P-葡萄糖巧酶的重要性，P-葡萄糖巧酶编码基因也已经从多种微生物中 被分离、鉴定出来，并被克隆、表达于不同的宿主，应用于不同的领域。在运些宿主中，酿酒 酵母作为传统的乙醇生产菌株，具有生长速度快、乙醇产率高、对抑制物的耐受性好等特 点，也是异源蛋白表达的良好平台之一化Zaldivar,J.化elsen,L.Olsson.化61ethanol productionfromlignocellulose:achallengeformetabolicengineeringand processintegration,ApplMicrobiolBiotechnol, 2001, 56:17-34;汪天虹主编，微生物 分子育种原理与技术，北京：化学工业出版社，2005)。但酿酒酵母没有利用纤维素的能 力，也不能吸收代谢纤维寡糖或纤维二糖。鉴于P-葡萄糖巧酶在多个领域的应用潜力和 木质纤维素酶酶系的高度复杂多样性，在酿酒酵母中高效表达P-葡萄糖巧酶单个组分， 自有其独特的应用价值和意义。
[0006] 迄今为止已有很多不同来源的P-葡萄糖巧酶基因在酿酒酵母中表达的报 道(vanZylWH,LyndLR,denHaanR,McBrideJE.Consolidatedbioprocessing forbioethanolproductionusingSaccharomycescerevisiae,AdvBiochemEng Biotechnol. 2007, 108:205-235 ;01son,D.G. ,McBride,J.E.,化aw,A.J. ,Lynd,L.R.Recent progressinconsolidatedbioprocessing,Curr.Opin.Biotechnol. 2012, 23:396-405)。 中国专利号2011100349269公开了一种编码P-葡萄糖巧酶的基因及重组表达载体及重组 酿酒酵母表达菌株及应用，其基因来自棘抱曲霉，已被证明在酿酒酵母中能很好表达，它解 决了基因来源、基因表达盒等问题，但同时仍然存在如下不足：游离型质粒载体不稳定、容 易丢失，需要选择性培养基进行菌体扩培、增加了培养成本，对木质纤维素料和一些不利理 化因素的适应性和抗逆性仍然有限，不能满足工业生产的需要。中国专利号201310187648X 提供了一株持续高效分泌P-葡萄糖巧酶的重组酿酒酵母菌株，该专利解决了基因表达稳 定性问题，但利用木质纤维素料产醇的水平偏低，仍然不能满足工业生产的需要。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是克服现有技术存在的不足，提供一种稳定、高效分泌表达P-葡 萄糖巧酶的重组酿酒酵母工业菌株。
[0008] 本发明的第二个目的是提供上述工业菌株在木质纤维素为原料生产乙醇中的应 用。
[0009] 本发明的第=个目的是提供上述工业菌株在催化合成烷基糖巧中的应用。
[0010] 本发明的技术方案概述如下：
[0011] 一种分泌表达P-葡萄糖巧酶的重组酿酒酵母工业菌株，其分类命名为酿酒酵 母（Saccharomycescerevisiae)ScBG，保藏于中国典型培养物保藏中屯、，保藏号为CCTCC N0:M2015488。
[0012] 分泌表达P-葡萄糖巧酶的重组酿酒酵母工业菌株在木质纤维素为原料生产乙 醇中的应用。
[0013] 木质纤维素优选为玉米忍、玉米賴杆或慷醒渣。
[0014] 分泌表达P-葡萄糖巧酶的重组酿酒酵母工业菌株在催化合成烷基糖巧中的应 用。 阳〇1引本发明的优点：
[0016] 本发明所得重组菌株具有低营养需求、高抗逆和高产醇的性能，对木质纤维素料 和一些不利理化因素的适应性、抗逆性强.
[0017] 进一步通过多拷贝5位点整合方式，将已被证明在酿酒酵母中有很好表达效果 的P-葡萄糖巧酶基因表达盒整合到染色体上，解决了游离型质粒载体不稳定、容易丢失 的问题，使P-葡萄糖巧酶能稳定、高效分泌表达，同时不需要选择性培养基进行菌体扩 培，降低了培养成本。本发明的重组酿酒酵母工业菌株能用于木质纤维素预处理料酶解产 醇的SSF工艺和糖、醇合成烷基糖巧。用于木质纤维素预处理料酶解产醇SSF工艺时添加 的营养盐可仅为尿素，营养需求简单；W工业废料慷醒渣为底物、固含量10%时的最大乙 醇浓度可达3. 757g/100mU相应纤维素到乙醇转化率可达理论值的90. 89 %;运对清洁有效 的利用废弃纤维素资源生产能源、解决当前能源危机具有极其重要的意义。同时，本发明的 重组酿酒酵母还能用于医药、食品、化工领域试剂的清洁生产。
[001引生物材料样品保藏
[0019] 本发明设及的分泌表达P-葡萄糖巧酶的重组酿酒酵母工业菌株，其分类命名为 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)ScBG，该菌株已于2015年8月14日保藏于地址为 中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中屯、，其保藏号CCTCCN0:M2015488。
【附图说明】
[0020] 图 1 为质粒pGEM-Teasy-Pl:pi-xyn2s-exon-Ta化I图谱。
[0021]图 2 为整合载体 pGEM- 5 R-URA-AaBG- 5 L 图谱。
[0022] 图3为转化子YPC(2%纤维二糖）限氧生长、发酵曲线图。（其中：A为生长曲线； B为
[0023] 纤维二糖和乙醇浓度曲线）
[0024] 图4为ScBG利用玉米忍酸碱预处理料同步糖化发酵产醇曲线。 阳0巧]图5为ScBG利用玉米賴杆汽爆料同步糖化发酵产醇曲线。
[00%] 图6为ScBG利用玉米忍工业废料慷醒渣同步糖化发酵产醇曲线。
【具体实