/100mL的尿 素母液至终浓度0. 033g/100mU充分混匀；第四步分装和接种：尽快将前述料浆分装到螺 口试管中，每管料浆5g，然后将前述新鲜种子液按接种后的起始菌体浓度为lg/L(折合约 4X107cells/mL)计算所需菌液量，取所需量菌液8000rpm、5min离屯、收集，保留50yL上清 液，抽吸混匀，尽快接入螺口试管中；对安琪酵母AADY干粉，则先按照商品说明书的指示复 水活化，然后控制复水活化后的菌液取50yL接入、起始菌体浓度亦为Ig/L;第五步梓紧前 述试管盖，30°C、150rpm限氧发酵，7化时取样进行HPLC分析，取相对高乙醇浓度的发酵液， 划线含有0. 8g/100mL乙酸和0. 6g/100mL慷醒的YTO培养基平板，密封，30°C培养数天至菌 落长出，重复进行前述玉米忍酸碱预处理料的同步糖化发酵评价，最后筛出a型单倍体菌 株，命名为Sc。
[0042] 进一步筛选得到尿喀晚营养缺陷型选择标记的单倍体菌株Sc 将上述单倍 体菌株Sc的YTO培养对数生长期新鲜菌液离屯、、无菌水洗涂，涂布到5-氣乳清酸（简称 5' -F0A)平板，30°C培养数天至菌落长出，再次转接划线同类平板，然后取长出菌落同时 接种补充和没有补充尿喀晚的液体基本培养基CMG(氨基酸碱基混合物（见表1)，0. 83g/ L;不含氨基酸的酵母氮源化ast化trogenBase(YNB)，6. 7g/L;葡萄糖，20g/L)，对比观察 生长情况，进一步确认其尿喀晚营养缺陷型表型。确认为尿喀晚营养缺陷型的菌株命名为 Sc册\
[0043] 表1氨基酸碱基混合物成分
[0044]
阳045] 注：省却特定的氨基酸成分，即可做成选择培养基。调抑值5. 6,葡萄糖110°C灭 菌15min，其它成分12TC灭菌21min，使用前混合。
[0046] 实施例3整合载体pGEM- 5 R-URA-AaBG- 5 L酶切线性化片段转化菌株Sc?感受 态细胞，得到重组工业菌株
[0047] 将实施例1中的整合载体pGEM- 5R-URA-AaBG- 5L用NotI酶切线性化，酶解液直 接转化实施例2中的酿酒酵母单倍体菌株Sc 首先使用尿喀晚营养缺陷型选择标记进行 筛选，即使用没有添加尿喀晚的CMG平板（简称URA平板）进行筛选，生长的菌落点接URA平板进一步鉴定。然后将点接平板生长正常的菌落接种到装有3mLYPC液体培养基（酵母 提取物yeastextract1%,蛋白腺peptone2%,纤维二糖cellobiose2%,w/v)的试 管中复筛，控制起始接种量尽可能一致。附带宿主菌株Sc?作为对照。3(TC、190rpm好氧 培养72h，取样测定00谢〇。 W48] YPC好氧生长复筛的部分转化子结果见表2。表2说明转化子确已整合有P-葡 萄糖巧酶基因，具有利用p-葡萄糖巧酶底物纤维二糖为唯一碳源好氧生长的能力，其中W5#菌株的ODee。值最高。
[0049]表2转化子YPC(2 %纤维二糖）好氧生长7化时的ODeeo值 阳化0]
口05。实施例4 P -葡萄糖巧酶基因表达工业菌株的进一步筛选
[0052] 转化子菌株表达P-葡萄糖巧酶基因的水平不同，转化纤维二糖为葡萄糖从而生 长、发酵产醇的能力也不同。取上述表2中1#W外的转化子菌株进行限氧条件下W纤维 二糖为唯一碳源的发酵：挑取各菌株YTO平板新鲜单菌落接种到3mL YTO液体培养基过夜 培养活化，在控制起始〇的6。= 0. 1的情况下转接到装有40mL YPC培养基的250mLS角烧 瓶中，封口膜密封瓶口，30°C、150rpm下限氧发酵72h，取样测定ODee。和通过高压液相色谱 0PLC)分析糖醇含量。
[005引 HPLC分析的具体操作如下：适量发酵液1200化pm、4°C、10min离心取上清液， 0. 22 ym的醋酸纤维滤膜过滤，滤液用于HPLC分析；HPLC分析条件如下：RID 1100，Aminex HPX-87H分离柱，4mM H2SO4为流动相，流速0. 5血/min,柱溫35°C，检测器溫度35°C，分析组 分包括乙醇、葡萄糖、纤维二糖等。
[0054]YPC厌氧生长发酵复筛的部分结果见图3。图3结果显示：转化子2#~5#、7#和 8#利用纤维二糖生长（图3A)和产醇（图3B)的能力彼此相当，都在4化进入生长稳定 期并基本耗尽纤维二糖（图3B)，也都在4化左右达到乙醇最高值；其中又W5#利用速度 更快些，其最大乙醇浓度为0. 6688旨/10〇111以糖醇转化率为理论值的65. 2%，乙醇产物得率 0. 35g/g底物；宿主菌株ScUKA不能利用纤维二糖生长和产醇。故选择5#作为后续实验使 用菌株，并重新命名为ScBG，见"生物材料样品保藏"。
[0055] 实施例5菌株ScBG表达P-葡萄糖巧酶基因的稳定性考察
[0056]挑取菌株ScBG的YTO平板生长菌落，接种到3mLYTO液体培养基中，30°C、190巧m 下好氧培养20h，测定ODee。值为5. 780,视为种子液。然后转接到3mLYTO液体培养基中， 控制起始〇〇(；(；。=〇.1，30°(：、190巧1]1下好氧培养1611，视为一次转接液；同类手法连续转接 15次，并对其中的第5、10、15次转接液，及时取新鲜菌液进行P-葡萄糖巧酶酶活测定，W 考察菌株P-葡萄糖巧酶菌液表达的稳定性。
[0057] 用pNPG(p-nit;ro地en}d-P-D-glucopyranoside，Sigma)作为底物测定P-葡萄 糖巧酶酶活，具体方法如下：1、制作标准曲线：6个灭菌的1.5血离屯、管中，分别加入不同 量的lOmM对硝基酪（p-nitro地enol，pNP)，制作出梯度浓度（0,0. 04,0. 08,0. 12,0. 16， 0. 20mM)的pNP溶液0. 5111以然后加入0. 5mL1M胞2〇)3,室溫放置5min，于405nm处测定其吸 光值，所得数据用于制作标准曲线。2、样品测定：在1. 5mL灭菌离屯、管中依次加入水、lOmM pNPG母液、250mMsodiumacetate母液和适量菌液（菌液的加入量W最终测定的〇〇4。5? 在0. 3-1. 5之间为准），控制反应最终总体积为0. 5血，其中的组分终浓度：5mMpNPG，50mM sodiumacetate,pH5.0。加入酶液启动反应起计时，50°C反应10分钟。加入0.5血IM 化2〇)3溶液终止反应，室溫放置5分钟。然后20000Xg、4°C离屯、5min，取上清液测定405皿 处的吸光值即〇〇4。5?。对照标准曲线换算出生成的pNP数量，计算酶活。1个酶活单位（lU) 为在测定条件下1分钟内水解产生ly molpNP所需的酶量。结果见表3。 阳05引表3酶活测定结果
[0059]
[0060] *注：为折合0Deee=l、lmL的菌液所含的酶活单位。
[0061] 由表3可知，菌株ScBG表达P-葡萄糖巧酶基因的水平是相当稳定的，证明将 P-葡萄糖巧酶基因整合到染色体上确实保证了基因的稳定表达，实验证明，培养基种类可 W为选择性培养基，也可W为非选择性培养基。
[0062] 实施例6菌株ScBG利用玉米忍酸碱预处理料同步糖化发酵产醇评价
[0063] 制料：将采自天津农场的玉米忍粉碎过筛，收集20-80目，采用稀硫酸-氨水预处 理方法制备其酸/碱预处理料：烘干的玉米忍颗粒与2%稀硫酸^1:1〇(肖:血）混合，1211： 下处理45min，过滤，固体用自来水洗至中性；然后与氨水W固液比1 :6(w:v)混合，60°C下 静置化后取出，水洗至中性；置于105°C下烘干，储存于-20°C下备用。测得其纤维素含量 为77. 1% (干重）。
[0064] 发酵种子液培养：挑取菌株ScBG和Sc?的YPD平板生长菌落，分别接种到3mL YTO液体培养基中，30°C、190rpm下好氧培养20h，进行一次活化；然后转接到YTO液体培养 基中，控制起始〇的6。= 0. 1，30°C、190巧m下好氧培养至0D660 >8 ;商品化安琪酵母（简称 Angel)则按照商品说明书的指示复水活化和操作。 阳0化]同步糖化发酵产醇评价：1)制备10 %固含量的料浆：称取3g上述预处理干料加 入到50血螺口锥形瓶中，加水，用硫酸/氨氧化钢溶液调节抑4. 5-5. 5,最终补水至料浆 总重30g，12rC、15min灭菌试添加酶制剂：使用宁夏和氏璧生物技术有限公司生产的固 体纤维素酶酶制剂，按lOFPU/g干重添加到前述料浆中，充分混匀；需要时另外添加丹麦诺 维信公司生产的商品化P-葡萄糖巧酶酶制剂Novozyme188,添加量按5CBU/g干重计算， 充分混匀；3)补充尿素：加入3. 3g/100血的尿素母液至终浓度0. 033g/100血，充分混匀； 4)接种：前述新鲜种子液，按接种后的起始菌体浓度为lg/L(折合约4Xl〇7cells/mL)计算 所需菌液量，取所需量菌液8000rpm、5min离屯、收集，保留~0. 3mL上清液，抽吸混匀，接入 装有灭菌料浆、酶制剂和尿素的锥形瓶中；若为安琪酵母干粉，控制复水活化后的菌液取~ 0. 3mL接入、起始菌体浓度亦为Ig/L;5)发酵：梓紧前述锥形瓶螺口瓶盖，30°C、150巧m限 氧发酵，定时取样进行HPLC分析。
[0066] 同步糖化发酵产醇曲线见图4。其中"+BG"表示在酶解发酵体系中额外添加了商 品化P-葡萄糖巧酶酶制剂，"-BG"表示没有添加。由图4可知：菌株ScBG在不添加P-