一株高产酸性蛋白酶的黑曲霉菌株及其液体发酵产酶方法
【技术领域】：
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，特别设及一株高产酸性蛋白酶的黑曲霉突变菌株 及其液体发酵技术。
【背景技术】：
[0002] 酸性蛋白酶（acidicprotease)在1954年首先由吉田在黑曲酶中发现。该酶广泛 存在于霉菌、和担子菌中，细菌中极少发现，其最适pH3~4,相对分子质量30000~40000， 等电点（pH3~5)。酸性蛋白酶主要是一种簇基蛋白酶，大多数在其活动中屯、含有2个天冬 氨酸残基。酶蛋白中酸性氨基酸含量高，而碱性氨基酸含量低。
[0003] 目前已经用于生产酸性蛋白酶的微生物菌株有：黑曲霉、米曲霉、拟青霉、啤酒酵 母、乳酸杆菌、枯草杆菌等，其中W黑曲霉为主，所产的蛋白酶具有一定的耐酸性和耐热性， 可广泛应用于酿酒、食品、饲料W及皮革加工等行业。
[0004] 如CN101638647A公布了一种产自黑曲霉的酸性蛋白酶，该酶最适抑2. 5-3. 5， 最适作用溫度40-50°C，采用固体发酵工艺的发酵产酶酶为47000U/g(W干曲计）。CN 101948820A公布了一种酸性蛋白酶及其制备方法，W黑曲霉CICC2238为产酶菌种，麦教 为主要原料生从的酸性蛋白酶最适抑2. 5-3. 5,最适作用溫度40-50°C，采用固体发酵工艺 制备的酸性蛋白酶酶活> 47000U/g，液体酶收率> 85%，固体酶收率> 80%。 阳〇化]但是由于受酶活及酶适用条件的制约，目前现有技术中酸性蛋白酶满足工业生产 的需求，所W选育一株高产酸性蛋白酶的黑曲霉菌株，其发酵产品具有良好的耐酸性和耐 热性，生产成本低廉，对大规模推进各行业的机械化具有重大意义。
【发明内容】
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[0006] 本发明的目的是提供一株高产酸性蛋白酶的黑曲霉突变株及其液体发酵产酶方 法。
[0007] 本发明中所述的高产酸性蛋白酶的黑曲霉菌株具体为黑曲霉（Aspergillus nige;r)TP-235,该菌株已于2015年5月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中屯、，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编 100101，保藏编号为CGMCCNo. 10789。
[0008] 所述菌株是由黑曲霉H43经常溫常压等离子体诱变选育获得，菌株形态特征如 下：镜检该菌所产菌丝体由具有横隔的分支菌丝构成，菌丛白色，顶囊大球形，小梗双层，抱 子量少。
[0009] 黑曲霉H43通过液态发酵后最高酶活为15856u/mU发酵过程中抱子量多，菌丝结 球，发酵液较为粘稠不利于传质，经诱变后抱子产量减少，菌丝不宜结球，种子罐培养周期 由5化缩短至48h，发酵液最高酶活为19247U/血。发酵方法经过优化后黑曲霉突变菌株 CGMCC10789的最高平均发酵液酶活达到21800u/mL至21900u/ml之间。
[0010] 本发明所述的液体发酵技术主要包括W下步骤： 柳川 1)斜面培养基如下：薦糖 25g，NaN〇32g，M拆〇4〇. 5g，KCl0. 5g，FeS〇4〇.Olg，KzHPOJg，琼脂20g，将上述各组分溶于1000血水中，调节抑至4. 5,121°C灭菌20min，备用； 阳〇1引。种子培养基配制如下：麦芽汁150mL，琼脂3g，调节抑至4. 5，m°C灭菌20min， 备用； 阳01引如种子罐培养基质量体积比为：教皮5%，皿2?〇4〇. 15%，CaCl2〇. 005%，调节抑至 4. 5,121-123°C灭菌 30-40min;
[0014] 4)发酵罐培养基质量体积比为：玉米粉5%，豆饼粉4%，硫酸锭1%，KH2P040 . 3%， 玉米浆 0. 6%，CaClzO. 5%，调节抑至 4. 5，121-123°C灭菌 30-40min; 阳01引 W补料瓶培养基质量体积比为：玉米淀粉10%，硫酸锭1%，KH2PO4O.1%，玉米浆 0. 6%，CaClzO. 5%，调节抑至 4. 5,121-123°C灭菌 30-40min;
[0016] 6)培养条件与方法：
[0017] 斜面培养：将所述黑曲霉突变株取一接种环菌苔接种于PDA固体斜面，30°C下恒 溫抬养7化；
[0018] 摇瓶培养：将斜面培养得到的菌株取一接种环菌苔接入种子培养基中，在初始 pH4. 5-5. 5、30°C、摇床转速200巧m条件下培养72h;
[0019] 种子罐培养：将摇瓶发酵后的种子液按照接种量5%的比例接入种子罐，在初始 pH4. 5-5. 5、30°C、转速 200-800巧m条件下培养 48h;
[0020] 发酵罐培养：将种子罐中的种子液按照接种量5%的比例接入发酵罐，培养条件 为初始抑 4. 5-5. 5、30°C、风量 0-24h0. 25vvm、24-48h0. 5vvm、48h-放罐l.Ovvm、转速 200-800巧m，发酵期间抑低于4. 5,补料控制抑4. 5-5. 5,至酶活增长缓慢，菌体自溶严重时 结束发酵，发酵周期为100-12化。
[0021] 所述酸性蛋白酶的提取与精制方法如下：
[0022] 向上述发酵液中加入3%珍珠岩助滤剂，进行板框压滤；用超滤膜对澄清压滤酶 液进行超滤浓缩；在浓缩液中加入稳定剂、防腐剂，然后用娃藻±进行过滤除菌，即得到酸 性蛋白酶成品酶制剂。 阳〇2引有益效果：
[0024] 1、本发明通过对黑曲霉原始菌株H43进行常溫常压等离子体诱变选育了一株高 产酸性蛋白酶的突变菌株，并对突变株CGMCC10789发酵过程进行补料条件优化使其酶活 达到 21800u/mL至 21900u/ml之间。 阳0巧]2、该突变菌株发酵得到的酸性蛋白酶最适抑范围为2. 5-3. 5,最适作用溫度范围 为55°C-65°C，在60°C保溫比后剩余酶活为78%，80°C保溫化后剩余酶活为58. 4%，具有 良好的耐酸性和耐热性，可应用于酿酒、食品、饲料W及皮革加工等行业。
【附图说明】：
[0026] 图1不同抑下的相对酶活
[0027] 图2不同溫度下的相对酶活
[0028] 图3 80°C下保溫0-化后的相对酶活
【具体实施方式】：
[0029] W下通过具体实施例对本发明做更详细的说明，具体实施案例仅为举例说明，不 作为对本发明实施范围的限定。
[0030] 实施例1菌株的诱变选育
[0031] 取两株出发菌株的新鲜斜面，用无菌水洗脱菌体，在有玻璃珠的试管振荡使菌体 分散，离屯、收集菌体，W5%甘油重悬菌体，W血球计数板计数直至菌浓为l〇7-l〇s个/mL，W 此作为出发菌悬液。
[0032] 开启常溫常压等离子系统，W酒精棉擦拭操作室内外，并开启紫外灯灭菌30min。 灭菌结束后取10yL菌悬液点于载片的粗糖面，并在无菌条件下将载片W綴子转移至操作 室台面上。开启氮气阀n，设定气流量和诱变时间进行诱变。诱变时间分别设定为90s、 120s、150s、180s、210s。每次诱变结束后均将载片置于含990yL无菌生理盐水的EP管中， 縱满震荡Imin。稀释涂布后置于30°C培养箱内培养。 阳的3]筛选培养基：酢酪素 0. 4%、KH2PO4O. 03%、M拆〇4?7&0 0. 05%、FeS〇4?7&0 0. 0002%、NaCl0. 1 %、ZnS〇4〇. 003 %、无水CaClzO. 0002 %、琼脂 2 %、抑4. 5-5. 5。
[0034] 平板初筛：
[0035] 初筛方法：将诱变后长出的菌落点种在筛选平板上，30°C培养4化后，观察其周围 透明圈大小，选取酪蛋白透明圈直径与菌落直径比值较大的菌落进行摇瓶复筛。
[0036] 摇瓶复筛：
[0037] 复筛方法：将诱变菌株接入发酵摇瓶进行发酵，30°C，220rpm，培养6化后W分光 光度法测定各突变株发酵酶活。 阳03引发酵培养基：豆饼粉3. 75 %，玉米粉0. 65 %，鱼粉0. 65 %，氯化锭1. 0 %，氯化巧 0.5%，憐酸二氨钢 0.2%，pH5. 5。
[0039] 通过摇瓶复筛选出5株具有较高酶活的突变株列表如下：
[0040]
[0041] 经再次的摇瓶发酵后选育出TP-235为稳定的最高酶活菌株。
[0042] 形态特征观察：
[0043] 突变菌株TP-235的形态特征为：镜检该菌所产菌丝体由具有横隔的分支菌丝构 成，菌丛白色，顶囊大球形，小梗双层，抱子量少。
[0044] 实施例2液体发酵生产酸性蛋白酶及其提取精制
[0045] 斜面培养：将所述黑曲霉突变株TP-235取一接种环菌苔接种于PDA固体斜面， 30°C下恒溫培养72h;
[0046] 摇瓶培养：将斜面培养得到的菌株取一接种环菌苔接入发酵种子培养基中，在初 始抑5.0、30°C、摇床转速20化pm条件下培养72h。
[0047] 种子罐培养：将摇瓶发酵后的种子液按照接种量5%的比例接入种子罐，在初始 抑5. 0、30°C、转速400巧m条件下培养48h。
[0048] 发酵罐培养：将种子罐中的种子液按照接种量5%的比例接入发酵罐，培养条件 为初始抑 5. 0、30°C、风量 0-24h0. 25vvm、24-48h0. 5vvm、48-放罐l.Ovvm、转速 400巧m， 发酵期间抑低于4. 5,补料控制抑5. 0,至酶活增长缓慢，菌体自溶严重时结束发酵，发酵周 期为1〇化。下表是5化发酵罐6批次的发酵产酶情况，平均产酶水平为21396u/mL。
[0049]
[(X)如]酸性蛋白酶的提取与精制:
[0051] 加入3%珍珠岩助滤剂，进行板框压滤；用超滤膜对澄清压滤酶液进行超滤浓缩； 在浓缩液中加入稳定剂、防腐剂，然后用娃藻±进行过滤除菌，即得到酸性蛋白酶成品酶制 剂。 阳0巧 1)斜面培养基如下：薦糖 25g，NaN〇32g，M拆〇4〇. 5g，KC1 0. 5g，FeS〇4〇.Olg， KzHPOJg，琼脂20g，将上述各组分溶于1000血水中，调节抑至4. 5,121°C灭菌20min，备用； 阳05引。种子培养基配制如下：麦芽汁150血，琼脂3g，调节抑至4. 5，12rC灭菌20min， 备用；
[0054]如种子罐培养基质量体积比为：教皮5%，皿2?〇4〇. 15%，CaCl2〇. 005%，调节抑至 4. 5,121-123°C灭菌 30-40min; 阳05引 4)发酵罐培养基质量体积比为：玉米粉5%，豆饼粉4%，硫酸锭1%，KH2P040 . 3%， 玉米浆 0.6%，CaClzO. 5%，调节抑至 4. 5，121-123°C灭菌 30-40min;
[0056]W补料瓶培养基质量体积比为：玉米淀粉10%，硫酸锭1 %，KH2PO4O. 1 %，