一种转化人参皂苷Rb1生产Rd的曲霉及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于中药技术领域，设及一种转化人参皂巧化1生产Rd的曲霉及应用。
【背景技术】
[0002] 人参（PanaxginsengG.A.Meyer)是我国珍贵的传统中药，应用于中医临床已有 二千多年的历史。人参的主要活性成份是人参皂巧（ginsenoside)，其中原人参二醇类皂巧 属于达玛烧型四环S祗皂巧，主要包括化1、化2、Rc、RdW及Rg3等。其中人参皂巧Rd对 屯、血管，免疫系统，神经系统等具有良好的药理作用，有些药理作用是人参皂巧Rd独有而 其他的单体皂巧所没有的。
[0003] 人参皂巧Rd在人参中含量较低，只有0. 2%左右，因其结构复杂，化学合成至今尚 未成功，目前从人参、=屯等植物根、茎、叶中提取来获得Rd单体，提取方法由于其收率低， 成本较高，影响了医疗保健市场需求的进一步扩大，因此有必要开发一种产率高，纯度好， 并且简单易行的制取人参皂巧Rd的方法。
[0004] 对比相对含量较高的人参皂巧化1，Rd与其结构差别在于Rd的C2。位末端少一个 葡萄糖残基。理论上可W通过将化1的C2。位末端葡萄糖残基水解掉得到人参皂巧Rd。目 前有研究试图利用加热、酸水解法、碱水解法等化学方法将主要人参皂巧转化为活性更高 的稀有皂巧。但是运些化学水解的条件都比较剧烈，不容易控制，而且在水解过程中能使皂 巧元发生脱水、环合、差向异构、径基化等反应，产生较多副产物，很难得到目标产物。生物 转化的区域和立体选择性强、反应条件溫和，运就使得酶转化法和微生物转化法制备稀有 人参皂巧受到青睐。
[0005] 从动物代谢角度分析，人参皂巧Rd可W由主要皂巧化1代谢而来，与其它皂巧不 同的是，在胃中并不能由人参皂巧化1水解得到人参皂巧Rd，也不能由肠道菌分解得到人 参皂巧Rd。目前只有利用微生物或微生物来源的酶转化得到人参皂巧Rd的研究报道，运些 研究中转化过程中存在转化产物不专一W及人参皂巧对酶的明显抑制作用，而且转化效率 较低，转化时间长。传统微生物转化应用存在局限性。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种高效转化人参皂巧化1生产Rd的 曲霉。
[0007] 本发明的第二个目的是提供上述曲霉转化人参皂巧化1生产Rd的的应用。
[0008] 本发明的技术方案概述如下：
[0009] 一种转化人参皂巧化1生产Rd的曲霉，其分类命名为曲霉（Aspergillus sp.)LFJ1403,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、，保藏号CGMCC No.11038。
[0010] 上述曲霉转化人参皂巧化1生产Rd的的应用。
[0011] 优选地，上述应用包括如下步骤：
[001引 （1)在28-32°C下，将PDA平板上培养2-3天的保藏号CGMCCNo. 11038的曲霉用 体积浓度为0. 05% -0. 3%的TweenSO溶液冲洗下来，用抑=5. 0的醋酸盐缓冲液稀释成 抱子浓度为在2. 0X106-8. 0X106个/mL范围内的抱子悬液；所述TweenSO溶液的溶剂为 pH= 5. 0的醋酸盐缓冲液；
[0013] (2)用抑=5. 0的醋酸盐缓冲液配制浓度为1. 2-1. 3mg/mL的人参皂巧化1溶液；
[0014] 做将步骤（1)获得的抱子悬液与步骤似获得的人参皂巧化1溶液等体积混合， 在35-38 °C、pH= 5. 0转化44-5化，得到人参皂巧Rd的转化液。
[001引本发明的优点：
[0016] 1、实验证明，本发明通过利用人参皂巧作为特定底物筛选菌株策略，筛得一株能 够转化人参皂巧化1生产稀有人参皂巧Rd的菌株LFJ1403。通过菌株鉴定方法确定该菌为 曲霉（Aspergillussp.LFJ1403，Genebankaccessionnumber:KM925044)。该曲霉目前未 有任何转化人参皂巧报道。
[0017] 2、通过对曲霉LFJ1403的转化产物的液相色谱及质谱分析。该菌转化人参皂巧 化1生产Rd具有专一'性（专一水解化1的〔2。位糖链末端P-1，6葡萄糖巧键），不会进一 步转化Rd生产其他皂巧产物。
[001引 3、通过四种不同转化体系转化人参皂巧化1的对比，证实了曲霉（Aspergillus sp.)LFJ1403在PDA固体培养产抱阶段外分泌大量转化人参皂巧化1产Rd的P-糖基水解 酶，据此制备而成的抱子悬液最佳转化体系具有简单高效易制备的优势。2-3天取抱制备的 抱子悬液人参皂巧化1转化活性最高。通过进一步优化转化条件人参皂巧化1转化率高达 96 % (w/w)0
【附图说明】
[0019] 图1-1至图1-2为人参皂巧化1及LFJ1403转化产物的高效液相色谱图：其中，图 1-1为人参皂巧化1的高效液相色谱图；图1-2为LFJ1403转化产物的高效液相色谱图。
[0020] 图2-1至图2-2为人参皂巧化1及LFJ1403转化产物的质谱图谱；其中，图2-1为 人参皂巧化1的质谱图谱，图2-2为LFJ1403转化产物的的质谱图谱。
[002。 图3为基于18SrDNA构建的曲霉LFJ1403与相关真菌的进化树。图中各真菌的 18SrDNA序列来自Genebank(序列号在进化树中已给出），Nei曲our-化ining方法构建该 树，Bootstrap设置为 1000;
[0022] 图4为不同取抱时间制备抱子悬液对人参皂巧Rd产率影响；
[0023] 图5.为不同转化体系对人参皂巧Rd产率影响；
[0024] 图6为不同人参皂巧化1底物浓度对人参皂巧Rd产率影响；
[00巧]图7为不同转化溫度对人参皂巧Rd产率影响；
[0026] 图8为不同初始抑对人参皂巧Rd产率影响；
[0027] 图9为不同转化时间对人参皂巧Rd产率影响；
[0028] 图10为抱子悬液在Q-Se地arose柱上的梯度洗脱图谱；（图中的带有S角形标记 的曲线为盐离子强度）
[0029] 图11为各单组份酶的P-糖基水解酶酶活检测；
[0030] 图12为第4号管单组份酶转化人参皂巧化1产Rd的高效液相色谱图；
[0031] 图13为第4号管单组份酶的SDS-PAGE电泳图（图中左边为Mark);
[0032]图14为化反应体系中不同转化时间对转化率的影响。
[003引菌种保藏：
[0034] 转化人参皂巧化1生产Rd的曲霉，其分类命名为曲霉（AspergillusSP.) LFJ1403,于2015年7月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、 (CGMCC)并存活，保藏号CGMCCNo. 11038,保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中 国科学院微生物研究所，邮政编码100101。
【具体实施方式】
[0035] 下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。
[0036] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0037] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[003引本发明所采用的化1购自吉林省宏久生物科技股份有限公司。公开化1的购买单 位是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但其它来源的化1也可W用于本发 明。
[0039] 实施例1
[0040] 人参皂巧化1转化菌株LFJ1403的筛选
[0041] (1)取来自吉林农业大学参园的±壤Ig，溶于5mL无菌水中得到该±壤的母液，再 将该母液分别用无菌水稀释10 1、10 2、10 3、10 4、10 5五个梯度。各梯度取200yL涂布含有 0.Ig/L氯霉素的PDA平板。3(TC倒置培养至单菌落长出，长出的各单菌落不断转接PDA平 板直至获得纯化的单菌落并4°C保存斜面备用。
[0042]PDA平板上长好的45株单菌落分别用适量20mmol/L醋酸盐缓冲液（抑=5. 0)冲 洗，同时将菌抱子轻轻刮下，转至灭菌=角瓶中，120rpm振荡2小时直至抱子在缓冲液中混 匀。将抱子用S层纱布过滤至50mL离屯、管（滤液为抱子悬液），用20mmol/L醋酸盐缓冲液 定容至20血，取1血放置于2. 5血离屯、管中，分别稀释10 1、10 2、10 3、10 4、10 5五个梯度，显 微镜下观察各梯度抱子数量，使最终抱子浓度为5. 0X1〇6个/mL。
[0043]PDA培养基为马铃馨葡萄糖琼脂培养基（g/L):马铃馨200,葡萄糖20,琼脂15,pH 自然。
[0044] 0)用抑=5. 0的醋酸盐缓冲液配制化1浓度为0. 25mg/mL;
[0045] 做将步骤（1)获得的抱子悬液与步骤似获得的溶液等体积混合，在30°C， 13化pm条件下反应。从0小时开始，每隔24小时取样一次，每次200yL，加入等体积正下 醇萃取两次，50°C挥干溶剂后用色谱纯甲醇定容lOOii