一种用于畜禽养殖的凝结芽孢杆菌制剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及畜禽养殖添加剂领域，尤其设及一种用于畜禽养殖的微生物制剂-凝 结芽抱杆菌及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 近年来，随着养殖业集约化、规模化的迅猛发展，养殖动物病害爆发越来越频繁， 危害也越来越大，养殖动物病害已经成为限制养殖业发展的瓶颈。
[0003] 抗生素等化学药剂在养殖业中的应用已有几十年的历史，对预防动物疾病，提高 养殖业的产量和质量起到了积极的作用。但随着认识的不断深入，人们发现长期使用抗生 素会破坏畜禽消化道内的微生物区系，使动物机体对抗生素产生抗药性，W及抗生素在畜 禽产品中的残留等，已经直接影响到人类的健康和生态环境的安全。因此寻找能够克服上 述弊端的抗生素替代物，开发新型安全的绿色饲料添加剂，已成为国内外学者关注和研究 的热点。
[0004] 微生态添加剂是一种采用营养缓释技术、生物发酵技术和特殊生产工艺培养而成 的一种多功能微生物制剂，它既不会产生抗药性，又无药物残留等问题，被认为是取代抗生 素最具潜力的饲料添加剂，得到了越来越多的重视。目前乳酸菌、芽抱杆菌是应用最为广泛 的微生态制剂。乳酸菌能为宿主提供可利用的必需氨基酸和各种维生素，有直接促进生长 的作用。芽抱杆菌能产生蛋白酶、脂肪酶、可溶性淀粉酶等活性物质，还能分泌抗菌素，在动 物肠道内具有较强生物夺氧能力，对促进动物体内乳酸菌、双歧杆菌等有益厌氧微生物的 生长，维持微生态平衡起到重要作用。因此，集中两者优点的产乳酸芽抱杆菌的研究在近年 来成为了益生菌菌株研发的热点。在发达国家已得到较多应用的凝结芽抱杆菌是饲用产乳 酸芽抱杆菌中最重要的一种，它不仅具有乳酸菌的所有特点，由于能产生芽抱，它还具有芽 抱杆菌所有的独特性，是当前较好的动物保健品种之一。早在1989年，美国FDA就公布了 41种可用于饲料的安全菌株，1992年再次批准42种，其中凝结芽抱杆菌排在第一位。我国 对凝结芽抱杆菌的研究开发起步较晚，近年来国内对凝结芽抱杆菌的研究多集中在医学方 面，并已取得了很好的疗效。用于治疗肠道菌群素乱引起的肠炎、腹泻、便秘、消化不良等， 效果显著。因此，开发出功能强，成本低、针对性强的畜禽养殖用微生态制剂已成为国内外 研究的重点。
【发明内容】
阳〇化]本发明目的在于，利用从自然环境中筛选的高效菌种，运用统计学方法和现代生 物发酵工程技术与手段，进行低成本、高密度产业化生产和先进的后处理加工工艺，作为抗 生素的替代物应用于养殖业，对促进畜牧业增产、增效及健康持续发展，具有显著的经济效 益和开发前景。本发明的另一目的是提供一种该微生物制剂的制备方法。
[0006] 本发明目的通过W下技术方案来实现。
[0007] 一种用于畜禽养殖的凝结芽抱杆菌制剂，其中，该制剂包括保藏在在中国武汉， 中国典型培养物保藏中屯、保藏，保藏编号为CCTCCNo:M2011422的BFS-2菌株。
[0008]种凝结芽抱杆菌度acilluscoagulans)BFS-2菌株：
[0009]我们从断奶仔猪肠道、菜园±壤、泡菜等不同来源中分离具有较高产酸能力的微 生物菌株，并结合细菌的形态特征、生理生化指标，16SrRNA分子鉴定等方式对获得的高效 菌株进行鉴定；并在此基础上，对获得的凝结芽抱杆菌的抑菌活性进行初步分析。结果表 明，从上述各种不同来源中总共分离得到产酸菌株43株，在经过产酸试验和耐酸、耐胆盐 试验初步筛选后，确定了3株微生物菌株。经过后续生理生化和分子鉴定，运3株均为凝结 芽抱杆菌。抑菌结果表明，运3株凝结芽抱杆菌对芽抱类杆菌的抑制效果较差，对大肠杆菌 等肠道条件致病菌的抑制情况较好，其中综合效果最好的菌株为BFS-2,该菌株取样分离自 浙江杭州的一个菜园。
[0010] 保藏菌株的形态、培养、生理、生化等特征：
[0011] 凝结芽抱杆菌BFS-2菌株：属芽抱杆菌度acilluscoagulans);革兰氏阳性菌，在MRS液体培养基中生长良好，细胞杆状，有芽抱；在MRS琼脂平板上培养时菌落圆形，边缘整 齐，规则，灰白色，表面有光泽。 阳01引该BFS-2菌株已于2011年11月25日，在中国武汉，中国典型培养物保藏中屯、保 藏，保藏编号：CCTCCNo:M2011422。
[0013] 另一方面，本发明提供一种制备用于畜禽养殖的微生物制剂-凝结芽抱杆菌制 剂，
[0014] 该制剂可按W下方法获得：W马铃馨葡萄糖固体培养基为斜面培养基；W马铃馨 葡萄糖液体培养基为摇瓶菌种培养基；按重量可溶性淀粉2-5 %，酵母膏0. 5-1 %，蛋白 腺0. 5-1. 5%，豆巧1. 0-1. 5%，水补足至100%配制成种子罐和发酵罐发酵培养基；W保 藏编号为CCTCCNo:M2011422的凝结芽抱杆菌度acilluscoagulans)BFS-2菌株为菌种， 经各级发酵后制备而成活菌数为lXl〇SCRJ/g的凝结芽抱杆菌。
[0015]用于畜禽养殖微生物制剂-凝结芽抱杆菌制剂的制备方法，按W下步骤进行：
[0016] (1)各级培养基的配制，其中：
[0017]a)斜面培养基：马铃馨葡萄糖固体培养基，备用；
[0018] b)摇瓶菌种培养基：马铃馨葡萄糖液体培养基，备用；
[0019]C)种子罐发酵培养基：按重量可溶性淀粉2-5%，酵母膏0.5-1%，蛋白腺0.5-1. 5%，豆巧 1. 0-1. 5%，水补足至 100% ;
[0020]d)发酵罐培养基：按重量可溶性淀粉2-5%，酵母膏0.5-1 %，蛋白腺0.5-1. 5%，豆巧 1. 0-1. 5%，水补足至 100%; 阳02U 似斜面菌种的培养：将保藏菌种：CGMCCNo. 2288凝结芽抱杆菌BFS-2菌株接种 于步骤（1)斜面培养基上，在28-37°C的培养箱中培养18-24小时，取出后直接应用或放 入冰箱中冷藏，备用；
[00巧 做摇瓶菌种扩增：在无菌操作下，取一环斜面菌种接入60ml步骤（1)摇瓶菌种 培养基中，于28-37°C，110-220转/分的摇床中，培养18-24小时，取出直接应用或放 入冰箱中冷藏，备用；
[002引 （4)种子罐发酵：将步骤（1)种子罐发酵培养基放入种子罐中，在种子罐内溫度 12rC保持30分钟后，保压至0.IMPa，进行蒸汽高溫灭菌后冷却至28-37°C;在火焰保护 下迅速通过接种阀口向种子罐内接入步骤（3)摇瓶菌种，接种量为5-10%;开动揽拌机在 转速110-220转/分，溫度28-37°C，通气量4mVh，罐压0. 02-0. 06MPa，pH自然，培养 18-24小时，备用；
[0024] (5)批量产品的制备：将步骤（1)发酵罐发酵培养基放入发酵罐中，在发酵罐内溫 度12rC，保压至0.IMPa，保持30分钟后把培养基冷却至28-37°C;通过移种管道向发酵罐 内接入步骤（4)种子罐菌种，接种量为5-10%;开动揽拌机在转速110-220转/分，溫度 28-37°C，通气量20mVh，罐压0. 02-0. 06MPa，抑自然，培养18-24小时，取样检验，根 据产品质量标准进行后处理（产品形态根据客户需要生产成固体或者液体），灌装，封口， 即成用于畜禽养殖的微生物制剂，其中，凝结芽抱活菌数为lXl〇SCRJ/g。
[00巧]畜禽养殖微生物制剂-凝结芽抱杆菌的应用方法：每吨饲料中按质量百分比为 0. 005-0. 1 %的用量添加微生物制剂-凝结芽抱杆菌，揽拌均匀后直接饲喂，其中，该制剂 包括保藏在在中国武汉，中国典型培养物保藏中屯、保藏，保藏编号为CCTCCNo:M2011422 的BFS-2菌株或该菌株的培养产物。运里的浓度可W为0. 005 %，0. 05 %，0. 1 %中的任何比 值。
[00%] 在一些优选的方式中，凝结芽抱杆菌的质量百分比为0. 05%。
[0027] 在一些优选的方式中，凝结芽抱活菌数为lX108-5X108CFU/g。
[0028] 对于保藏细菌的生物学特性说