一种以蓝藻沼液为基质发酵Bt的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种以蓝藻沼液为基质发酵Bt的方法，属农药技术领域。
【背景技术】
[0002]苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensi Berliner (Bt)是一类革兰氏阳性细菌，在代谢过程中能产生伴胞晶体、α-外毒素、外毒素等多种对鳞翅目、膜翅目、双翅目等9个目500多种害虫有毒杀作用的物质，且对人畜和环境无害，目前已成为世界上产量最大的生物杀虫剂，广泛用于农林果蔬害虫的防治。目前Bt的生产主要以液体深层发酵为主，此外还有部分固态发酵，其碳源主要用糖类和玉米淀粉，氮源主要利用有机氮化合物，如鱼粉、豆柏粉、蛋白胨等，生产成本较高，是目前生物源杀虫剂普及的主要限制因素之一。因此如何降低Bt的生产成本是近年来国内外的研究热点。已有研究报道，可利用味精生产废水、废啤酒酵母浸出液、废蜜糖、乳清、污泥等发酵生产Bt，但仍存在原料处理工序繁琐、成本相对较高、后期处理工艺复杂、产品质量稳定性差等诸多问题。
[0003]与此同时，经济快速发展及污染物排放增加导致大量湖泊水库的水体出现了富营养化，夏季藻爆发已成为一大环境公害。对蓝藻的治理目前仍以机械打捞分离为主，打捞出的蓝藻不能直接被家畜食用，也无法直接提取蛋白，堆积在岸边不仅占用土地，其产生的藻毒素、多环芳烃(PAHs)及NH3、H2S等物质还会二次污染环境。如何妥善处理这些藻泥有机废弃物，是湖泊污染治理中迫切需要解决的难题。目前对蓝藻藻泥主要以焚烧发电、转化生产有机肥为主，但受其水分含量过高等因素制约，尚不能满足当前的实际需要。研究表明新鲜蓝藻用于发酵制备Bt生物杀虫剂具有一定可行性，由于新鲜蓝藻本身含藻毒素等多种毒素，直接喷施对植物有不利效果，但发酵后藻毒素降低。另外蓝藻较易腐烂发酵，新鲜蓝藻制备Bt使用不便。因此考虑使用蓝藻沼液作为基质发酵制备Bt。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于克服现有技术之不足，而提供一种利用蓝藻沼液为基质发酵Bt的制备方法，
[0005]本发明的以蓝藻沼液为基质发酵Bt的方法，具体步骤如下:
[0006](1)原料选择:
[0007]成分及质量百分比为:微囊藻属93.12%，鱼腥藻属1.66%，束丝藻属1.72%，绿藻门2.99%，硅藻门0.51%的新鲜蓝藻；
[0008]菌种标准编号:FSCC(T) 115030，GIMCC编号:G頂1.32的苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis);该菌种于2013年06月18日向广东省微生物菌株保藏中心购买，地址:广州市先烈中路100号实验楼五楼。
[0009]常规的LB液体培养基:胰蛋白胨:40 %，酵母提取物:20 %，氯化钠40 % ;或含固率1-3%的常规的蓝藻沼液培养基。
[0010](2)蓝藻沼液制备
[0011]用10-25L不锈钢厌氧发酵罐，加入占罐容积20-50%的蓝藻藻泥，排氧温度30°C下自然发酵发酵2个月。
[0012](3)Bt GIM1.32 菌种活化:
[0013]在250-500mL锥形瓶中装入配置好的100_200mL常规LB液体培养基并在103.4kPa，121.3°C下灭菌15min。无菌操作台上用浸过70-80%的酒精脱脂棉擦净菌种冻干管，用火焰加热顶部，滴无菌水使冻干管顶端破裂，用镊子敲破冻干管，取50-150mg菌种置于LB液体培养基中，在温度25-35°C、50-150rpm/min的条件下培养活化5_20h。用无菌月旲封口后放入2 C冰箱冷减备用。
[0014](4)发酵:在0.5-1L锥形瓶中加入100-300mL LB培养基或含固率1_3%的蓝藻沼液培养基并在103.4kPa，121.3°C下灭菌15min，每瓶接种1_3%已活化的pH值为5.0-8.0的Bt GIM1.32，在温度25-35°C、50-150rpm/min的条件下培养发酵40_60h。大批量生产时按比例扩大。
[0015](5)干燥:采用_55°C，4Pa常规真空冷冻干燥法对上述发酵脱水处理，当含水率小于质量百分比5%时即得到发酵Bt原粉。
[0016]本发明所用仪器为常规的市购仪器。
[0017]本发明的优点在于:
[0018]1、与沼渣、啤酒糟、玉米粉、豆饼粉、米糠、及麦麸传统底物相比，能够使生产Bt的成本大幅降低；
[0019]2、利用发酵了 2个月的蓝藻沼液制备Bt，成品晶体蛋白含量1.87g/L、毒力效价679.89IU/ μ L、LC50 0.353mL/L，均大于利用传统培养基同条件制备的Bt ；
[0020]3、产毒素性能整体上较常规LB培养基优良，成品效价高，分散性好，质量好，同时提升了蓝藻资源化再利用率；
[0021]4、按比例扩大后能用于大批量生产。
【具体实施方式】
[0022]下面通过实施例对本发明作详细说明。本实施例所用仪器为常规的市购仪器。
[0023]本发明的以蓝藻沼液为基质发酵Bt的方法，具体步骤如下:
[0024](1)原料选择:
[0025]成分及质量百分比为:微囊藻属93.12%，鱼腥藻属1.66%，束丝藻属1.72%，绿藻门2.99%，硅藻门0.51%的新鲜蓝藻；
[0026]菌种标准编号:FSCC(T) 115030，GIMCC编号:G頂1.32的苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis);该菌种于2013年06月18日向广东省微生物菌株保藏中心购买，地址:广州市先烈中路100号实验楼五楼。
[0027]常规的LB液体培养基:胰蛋白胨:40%，酵母提取物:20%，氯化钠40%;或含固率1-3%的常规的蓝藻培养基。
[0028](2)蓝藻沼液制备
[0029]用10L或25L不锈钢厌氧发酵罐，加入蓝藻藻泥占罐容积的20%或50%，排氧温度30°C下自然发酵发酵2个月。
[0030](3)Bt GIM1.32 菌种活化:
[0031]在250mL或500mL锥形瓶中装入配置好的100mL或200mL常规LB液体培养基并在103.4kPa，121.3°C下灭菌15min。无菌操作台上用浸过70%或80%的酒精脱脂棉擦净菌种冻干管，用火焰加热顶部，滴无菌水使冻干管顶端破裂，用镊子敲破冻干管，取50mg或150mg菌种置于LB液体培养基中，在温度25°C或35°C、50rpm/min或150rpm/min的条件下培养活化5h或20h。用无菌膜封口后放入2°C冰箱冷藏备用。
[0032](4)发酵:在0.5L或1L锥形瓶中加入100mL或300mL LB培养基或含固率1%或3%的蓝藻沼液培养基并在103.4kPa，121.3°C下灭菌15min，每瓶接种1%或3%已活化的pH 值为 5.0 或 8.0 的菌种活化的 Bt GIM1.32，在温度 25。。或 35°C、50rpm/min 或 150rpm/min的条件下培养发酵40h或60h。大批量生产时按比例扩大。
[0033](5)干燥:采用_55°C，4Pa常规真空冷冻干燥法对上述发酵脱水处理，当含水率小于质量百分比5%时即得到发酵Bt原粉。
[0034]实际应用表明:本方法不仅成本大幅降低，且成品效价高，分散性好，产量大，质量好。
【主权项】
1.一种本发明的以蓝藻沼液为基质发酵Bt的方法，其特征在于方法的该具体步骤如下: (1)原料选择 成分及质量百分比为:微囊藻属93.12%,鱼腥藻属1.66%，束丝藻属1.72%，绿藻门.2.99%，硅藻门0.51%的新鲜蓝藻； 菌种标准编号:FSCC(T) 115030，GHCC编号:GIM1.32的苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis)； 常规的LB液体培养基:胰蛋白胨:40%，酵母提取物:20%，氯化钠40% ;或含固率.1-3%的常规的蓝藻沼液培养基； (2)蓝藻沼液制备 用10-25L不锈钢厌氧发酵罐，加入占罐容积20-50%的蓝藻藻泥，排氧温度30°C下自然发酵发酵2个月； (3)BtGIM1.32菌种活化 在250-500mL锥形瓶中装入配置好的100_200mL常规LB液体培养基并在103.4kPa，.121.3°C下灭菌15min，无菌操作台上用浸过70-80%的酒精脱脂棉擦净菌种冻干管，用火焰加热顶部，滴无菌水使冻干管顶端破裂，用镊子敲破冻干管，取50-150mg菌种置于LB液体培养基中，在温度25-35°C、50-150rpm/min的条件下培养活化5_20h ;用无菌膜封口后放入2 °C冰箱冷藏备用； (4)发酵 在0.5-1L锥形瓶中加入100-300mL LB培养基或含固率1_3%的蓝藻沼液培养基并在.103.4kPa，121.3°C下灭菌 15min，每瓶接种 1_3% 已活化的 pH值为 5.0-8.0 的 Bt GIM1.32，在温度25-35°C、50-150rpm/min的条件下培养发酵40_60h ； (5)干燥 采用-55°C，4Pa常规真空冷冻干燥法对上述发酵脱水处理，当含水率小于质量百分比.5%时即得到发酵Bt原粉。
【专利摘要】本发明涉及一种以蓝藻沼液为基质发酵Bt的方法，属农药技术领域。本发明的以蓝藻沼液为基质发酵Bt的方法包括：原料选择、蓝藻沼液制备、Bt？GIM1.32菌种活化、发酵、及干燥步骤。本发明的有益效果在于：1、与沼渣、啤酒糟、玉米粉、豆饼粉、米糠、及麦麸传统底物相比，能够使生产Bt的成本大幅降低；2、利用发酵了2个月的蓝藻沼液制备Bt，成品晶体蛋白含量1.87g/L、毒力效价679.89IU/μL、LC50？0.353mL/L，均大于利用传统培养基同条件制备的Bt；3、产毒素性能整体上较常规LB培养基优良，成品效价高，分散性好，质量好，同时提升了蓝藻资源化再利用率；4、按比例扩大后能用于大批量生产。
【IPC分类】C12N1/20, C12R1/07
【公开号】CN105296403
【申请号】CN201510865971
【发明人】张乃明, 谭超, 秦太峰, 包立
【申请人】云南农业大学
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年12月1日