一种紫丁香蘑菌株及其液体菌种与制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物技术领域，具体设及一种紫下香磨菌株及其液体菌种与制备方 法。
【背景技术】
[0002] 紫下香磨η化/a度ull.)Cooke]是一种香味浓郁，色泽艳丽，营养丰富 的食用菌，在发过被公认为上等食物。不仅如此，紫下香磨在抗癌试验中还表现出对小白鼠 肿瘤的抑制高达90%，对艾氏癌的抑制率更是高达100%。但是目前市场上的菌种都是出于 垄断地位的法国的紫下香磨的菌种，而我国自己的紫下香磨菌种还是稀缺的，运主要是由 于我们的菌种性状不稳定，菌种的独特性导致培养方法与法国菌种培养方法不尽相同，因 此我们迫切需要研究出我国自己的菌株，打破法国在紫下香磨菌种的垄断地位，并研究出 相应的培养方法，进行配套的生产栽培技术，有效的提高我们的紫下香磨的产量等。
[0003] 在紫下香磨的优良菌种的获得是关键技术环节。目前国内大多采用固体制种技 术，而很少使用液体发酵。对于固体制种技术而言，液体发酵技术具有具有菌丝生长良好、 菌球均匀、性状稳定，较少污染、培养基利用充分的优点。本专利采用液体发酵技术制作品 质优良、性状稳定的液体菌种，对后期人工栽培和医学研究提供保障。
【发明内容】
[0004] 本发明第一目的在于提供一种紫下香磨菌株，第二目的在于提供一种紫下香磨 M-012#的液体菌种，第Ξ目的在于提供所述紫下香磨M-012 #的液体菌种的制备方法。
[0005] 本发明第一目的是运样实现的，所述的紫下香磨菌株为紫下香磨M-012#菌株，保 藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、（CGMCC)，保藏日：2015年8月21 日，保藏编号：CGMCCNo. 11206 ;所述紫下香磨M-012#菌株属于真菌界，担子菌口，伞菌纲， 伞菌目，口磨科，香磨属。
[0006] 紫下香磨M-012#菌株的获得与鉴定 1、将采集的紫下香磨子实体内壁组织块接种到试管琼脂培养基斜面上，于18~24°C下 培养5~lOd，对分离培养的试管每天观察记录，及时剔除已污染的试管，挑选出无污染、长势 良好且菌核生成能力强的菌株，获得紫下香磨分离试管种，所述的试管琼脂培养基的配方： 马铃馨16g，葡萄糖1.6g，KH2PO40.〇3g，琼脂1.6g，Μ拆〇40. 02g，蒸馈水100ml，抑7. 0 ;培 养溫度20~28 °C。
[0007] 2、将紫下香磨分离试管种菌丝体接种到平板培养皿上进行菌种纯化，培养条件为 18~24°C下避光，所述的琼脂培养基的配方：马铃馨16g，葡萄糖1.6g，KH2PO40.〇3g，琼脂 1.6g，M拆〇40.02g，蒸馈水100ml，抑7. 0;培养溫度20~28°C;2d后取尖端菌丝块接种在培 养基斜面上，所述的培养基配方：马铃馨16g，葡萄糖1.6g，KH2PO40.〇3g，琼脂1.6g，Μ拆〇4 0.02g，蒸馈水100ml，抑7. 0;于18~24°C下培养5~7d，获得紫下香磨纯化试管种。
[0008] 3、采用供试子实体与对应菌丝分离物，分别按CTAB方法提取紫下香磨总DNA，进 行PCR扩增及ITS序列测定，将所测得试验样品的ITS序列提交NCBI数据库进行BLAST序 列比对分析，与NCBI中的紫下香磨（Z.Λ化劫序列Identities= 606/606(100%)，Gaps= 0/606 (0%)，分析确定分离得到的纯培养物为本发明所述的紫下香磨（Z.nw/a)菌丝体。
[0009] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：一是菌丝体生物量高，可达28g/Kg，而固 体菌包菌丝体生物量大约在6~13g/Kg ;二是菌丝生长速度快，在直径10cm的平板上菌丝 只要7d就可W长满平板；Ξ是培养污染率低，《2%。同时采用液体发酵法时间短，大约 72~9化，而普通的固体包培养需要15dW上。
[0010] 本发明利用云南原产地紫下香磨子实体筛选出优良菌株，为紫下香磨人工栽培提 供优良菌种。
[0011] 本发明所提供的紫下香磨M-012#菌株保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中屯、；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2015年08月21日； 保藏登记入册的编号CGMCCNO. 11206。
[0012] 本发明第二目的是运样实现的，是W所述紫下香磨菌株M-012#经斜面培养、种子 培养、发酵后制成的液体菌种。
[0013] 本发明的第Ξ目的是运样实现的，包括斜面培养、种子培养、发酵步骤，具体包 括： A、 斜面培养：将紫下香磨菌株M-012#的菌丝体接种到试管琼脂培养基斜面上，在溫度 为18~24°C下培养5~7山得试管菌种； B、 种子培养：将试管菌种接种到液体培养基中，在溫度为20~26°C下摇床培养5~lid， 得液体发酵种子； C、 发酵：将液体发酵种子按发酵培养基质量分数5~9%的量接种入发酵罐，在罐压 0. 03~0. 05MPa，溫度21~23°C，pH值7. 0~8. 0,揽拌速度130~150r/min，通气量70~90〇/〇下 培养80~90h，得到紫下香磨M-012#的液体菌种。
[0014] 本发明解决的技术问题是：一是从紫下香磨（Z.nw/a)发生地一一云南省昆明市 双龙乡野鸭湖野生附近生长的该菌的子实体进行组织分离培养得到，具有明显的地域性特 征；二是克服现有技术菌丝生长不均匀、污染率高、培养基利用不充分等不足。其目的是提 供一种具有产量高、菌丝生长快速、抗污染的新的优良紫下香磨菌株及其培养方法。
[0015] 本发明的有益效果是：一是菌丝体生物量高，可达28g/Kg，而固体菌包菌丝体生 物量大约在6-13g/Kg ;二是菌丝生长速度快，在直径10cm的平板上菌丝只要7d就可W长 满平板；Ξ是培养污染率低，《2%。同时采用液体发酵法时间短，大约72~9化，而普通的固 体包培养需要15dW上。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不W任何方式对本发明加W限制， 基于本发明教导所作的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。
[0017] 本发明所述的紫下香磨菌株为紫下香磨M-012#菌株，保藏单位：中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中屯、（CGMCC)，保藏日：2015年8月21日，保藏编号：CGMCC No. 11206;所述紫下香磨M-012#菌株属于真菌界，担子菌口，伞菌纲，伞菌目，口磨科，香磨 属。
[0018] 本发明所述的紫下香磨M-012#的液体菌种，是W所述紫下香磨菌株M-012#经斜面 培养、种子培养、发酵后制成的液体菌种。
[0019] 本发明所述的紫下香磨M-012#的液体菌种的制备方法，包括斜面培养、种子培养、 发酵步骤，具体包括： A、 斜面培养：将紫下香磨菌株M-012#的菌丝体接种到试管琼脂培养基斜面上，在溫度 为18~24°C下培养5~7山得试管菌种； B、 种子培养：将试管菌种接种到液体培养基中，在溫度为20~26°C下摇床培养5~lid， 得液体发酵种子； C、 发酵：将液体发酵种子按发酵培养基质量分数5~9%的量接种入发酵罐，在罐压 0. 03~0. 05MPa，溫度21~23°C，pH值7. 0~8. 0,揽拌速度130~150r/min，通气量70~90〇/〇下 培养80~90h，得到紫下香磨M-012#的液体菌种。
[0020] A步骤中所述的试管琼脂培养基为改良PDA培养基，其成分为：马铃馨15~17g，葡 萄糖1. 5~1. 7邑，皿2口〇4 0. 02~0. 04g，琼脂1. 5~1. 7g，M拆〇40. 01~0. 03g，其余为水，抑值为 7. 0。
[0021]B步骤中所述的液体培养基的成分为：教皮5~lOg，黄豆粉0.5~Ig，麦芽糖 0. 5~Ig，可溶性淀粉1~2g，其余为水，抑值为7.0。
[0022] C步骤中所述的发酵培养基的成分为：教皮5~lOg，黄豆粉0.5~Ig，麦芽糖 0. 5~Ig，可溶性淀粉1~2g，其余为水，抑值为7.0~8.0。
[0023] 下面通过实施例加W说明： 下述实施例中使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0024] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[00巧]W下实施例野生紫下香磨在云南省昆明市双龙乡野鸭湖边采集；采集方法为徒手 采集，采集时候注意保持子实体完整、无霉变、无病虫害。
[0026] 实施例1 1.1紫下香磨M-012#的获得 (1)将采集的野生紫下香磨子实体切成块即组织块，将组织块接种到菌种分离纯化培养 基斜面上，于18°C下培养lOd，对分离培养的试管每天观察记录，及时剔除已污染的试管， 挑选出无污染、长势良好的菌株，获得紫下香磨分离试管种；所述的菌种分离纯化培养基的 配方为： 似将紫下香磨分离试管种菌丝块接种到琼脂培养基的平板培养皿上进行菌种纯化， 培养条件为18~24°C避光，所述的琼脂培养基的配方：马铃馨30g，葡萄糖2g，K2HPO4O. 5邑， 琼脂2g，蒸馈水100ml，pH7. 0,培养溫度20~25°C;2d后取尖端菌丝块接种在培养基斜面 上，于18°C下培养7山获得紫下香磨纯化试管种即为获得的新的紫下香磨菌株，所述的培 养基配方法：马铃馨30g，葡萄糖2g，K2HPO4O. 5g，琼脂2g，蒸馈水100ml，pH7. 0,培养溫度 20~25°C。
[0027] 通过菌丝体产量、菌核生成能力、抗污染力等性状比对，挑选出菌丝体产量高、菌 核生成能力强、抗污染的紫下香磨液体菌种专用菌株M-012#。
[0028] 1. 2鉴定及其特征、命名、保藏 (1)子实体特征 M-012# 分离用子实体特征为：菌盖直径3. 5~10cm，半球形至平展，有时中部下凹，亮紫色或下 香紫色变至褐紫色，光滑，湿润，边缘内卷，无条纹。菌肉淡紫色，较厚。菌權紫色，密，直生 至稍延生，不等长，往生边缘呈小银齿状。菌柄长4~9畑1，粗0. 5~2畑1，圆柱形，同菌盖色，初 期上部有絮状粉末，下部光滑或具纵条纹，内实，基部稍膨大。抱子印肉粉色。抱子无色，楠 圆形，近光滑，具有小麻点，5.0~7.5μmX3.0~5.0μm。形态鉴定参考《中国大型真菌》（卯 晓试.郑州：河南科学技术出版社，2000.)。
[0029] 似紫下香磨M-012#菌株纯化试管种特征 接种后，在培养溫度为22°C的条件下，1化就开始萌发，生长初期菌丝紧贴培养基， 无色，有光泽，一般为较粗的不分支或分支较少的菌丝；第一天长速最快为1.1cm，最慢为 0. 3cm，而后随菌落的增大，有叉状或树枝状分支，一般较细，前两天无菌核与色素产生，第 Ξ天生长最快，平均长速为0. 70cm/d，并开始有色素产生，第九天到第十天长满整个培养 皿。
[0030] (3)ITS序列分析 采用供试野生紫下香磨子实体与实施例1获得的对应的紫下香磨纯化试管种菌丝，分 别按CTAB法提取总DNA，进行PCR扩增及口S序列测定，通过Blast对比样品的口S序列与 NCBI中的紫下香磨（Z.Λ化劫序列Identities= 606/606(100%)，Gaps= 0/606(0%)，分析 确定实施例1分离得到的紫下香磨纯化试管种即新的紫下香磨菌株为紫下香磨菌丝体。其 具体方法如下： 改良CTAB法流程 i称取0. 12g左右的干燥样品，加入液氮并迅速研磨至粉状后，迅速加入-(：ΤΑΒ50〇μ1、β-琉基乙醇2〇μ1，再加+CTAB(65°C预热）70〇μ1，混匀后置65°C水浴振荡抽提60min; ii冷却，1200化离