生产低内毒素的壳聚糖的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种生产低内毒素的碱性壳聚糖的方法，并且还涉及一种生产低内毒 素的中性壳聚糖、低内毒素的中性壳聚糖盐和低内毒素的中性壳聚糖衍生物的方法，以及 涉及上述方法的产品。
【背景技术】
[0002] 壳聚糖在制备用于控制出血的止血材料中是尤其有用的。
[0003] 壳聚糖是来自水生贝壳类动物加工的固体废弃物的衍生物，并且能够从真菌培养 物中提取。壳聚糖是非水溶性阳离子聚合材料。在将壳聚糖用于止血材料之前，通常首先 将其转化成水溶性盐。这样一来，壳聚糖盐就能够溶解在血液中从而形成阻滞血流的凝胶。
[0004] 由于壳聚糖在体内容易分解，所以壳聚糖盐非常适用于本文所述的应用。壳聚糖 通过溶菌酶而转化为葡萄糖胺，并且因此自然地从体内排出。从而不需要从体内移除壳聚 糖。此外，壳聚糖盐表现出适度的抗菌性，从而它们的使用降低了感染的风险。
[0005] 为了将壳聚糖用于制备适用于控制出血的止血材料，必须确保壳聚糖具有足够低 浓度的内毒素。
[0006] 内毒素是存在于革兰氏阴性菌的外膜的表面上的脂多糖。内毒素对哺乳动物，尤 其是对人的毒性很强，并且众所周知地难以从材料中移除。当内毒素释放至血液或通常未 发现内毒素的其它组织时，内毒素可成为热原。因此，必须从药学上可接受的产品中移除内 毒素。
[0007] 对热原进行处理以移除或破坏致热原（尤其是内毒素）被称为"去致热原"的方 法。用于含内毒素的材料的去致热原的技术包括离子交换层析、超滤、蒸馏以及旨在破坏内 毒素的各种化学方法。
[0008] W02008063503涉及一种从壳聚糖中移除内毒素的方法，所述方法包括以下步骤：
[0009] a)在无菌环境中利用无菌无致热原的设备和材料；
[0010] b)使含内毒素的壳聚糖溶胀长达24小时；
[0011] C)使lkg/25L至I. 5kg/25L的壳聚糖溶解在0· OlM至4. OM的氢氧化物的碱中；
[0012] d)连续地搅拌所得到的壳聚糖碱溶液；
[0013] e)在60°C~100°C加热并搅拌上述溶液45分钟至4小时
[0014] f)利用高达10倍体积的无内毒素超纯水漂洗上述溶液；
[0015] g)对上述溶液进行中和至6. 8至7. 5之间的pH ;
[0016] h)形成低内毒素的超纯壳聚糖浆液，将其转移至无内毒素的封闭系统；
[0017] i)从上述浆液中移除过量的水。
[0018] 这是复杂且昂贵的方法，特别是需要无菌设备，并且需要用10倍体积的无内毒素 的水溶液进行漂洗。
[0019] US2006293509涉及一种制备具有低内毒素的水溶性壳聚糖的方法，包括：
[0020] (a)使非水溶性壳聚糖与碱性溶液接触超过1小时的第一时段；
[0021] (b)有利地，利用无内毒素的水漂洗非水溶性壳聚糖以移除残余的碱性溶液；
[0022] (C)在含相转移剂的反应溶液中，使上述非水溶性壳聚糖部分乙酰化；
[0023] (d)使部分乙酰化的水溶性壳聚糖溶解在含表面活性剂且pH为约7. 0至约7. 4的 水性溶液中；
[0024] (e)将水混溶性溶剂加入至该水性溶液中，并且进一步将水性溶液的pH调节至至 少8. 0的pH以导致具有低内毒素含量的水溶性壳聚糖从该水性溶液/水混溶性溶剂混合 物中沉淀出来；以及
[0025] (f)可选地，用非溶剂（non-solvent)，诸如异丙醇进行清洗。
[0026] 然而，该方法是复杂且昂贵的，并且预期涉及使用大量的无内毒素的水或其它液 体。该方法同样需要使用相转移剂，并且耗时几个小时。
[0027] TW593342涉及一种降低壳聚糖中内毒素的方法，所述方法包括：
[0028] (a)使含内毒素的壳聚糖溶解在水性溶液中；
[0029] (b)使上述水性溶液与表面活性剂接触以形成不溶性固体和内毒性含量降低的水 性溶液；
[0030] (C)利用固/液分离手段来分离固体和水性溶液。
[0031] 然而，该方法需要表面活性剂来与溶解的壳聚糖发生反应以产生不溶性固体。所 得到的固体将为壳聚糖和表面活性剂或壳聚糖与表面活性剂之间的反应产物的混合物。
[0032] 本发明旨在解决上述难题。
【发明内容】
[0033] 根据本发明的第一方面，提供了一种生产低内毒素碱性的壳聚糖、低内毒素碱性 的壳质或它们的衍生物的方法，所述方法包括以下步骤：
[0034] (a)使壳聚糖、壳质、壳聚糖衍生物或壳质衍生物与浓度小于0. 25M的碱性溶液接 触以形成混合物；以及
[0035] (b)使所述混合物放置小于12小时的时段。
[0036] 本发明的方法可进一步包括对所述混合物进行干燥的步骤（C)。
[0037] 本发明的方法提供了得到具有低内毒素浓度的碱性的壳聚糖、壳质、壳聚糖衍生 物或壳质衍生物的有效方式。有利地，该方法并不需要清洗步骤、漂洗步骤，不需要使用表 面活性剂或相转移剂、无菌设备，和/或不需要使用无内毒素的水。进一步地，也不需要专 门的空气过滤或无菌条件。优选地，本发明的方法不包括使壳聚糖乙酰化的步骤。进一步 地，本发明的方法并不需要使用无内毒素的设备。与需要这些设备的方法相比，这就降低了 本方法的成本，从而是尤其有利的。
[0038] 术语"壳聚糖衍生物"在本文中是指部分去乙酰化的壳质，根据所需，可具有不同 的去乙酰化百分比。通常，适用于本发明的部分去乙酰化的壳质具有高于约50%的去乙酰 化程度，更通常具有高于约75%的去乙酰化程度，并且最通常具有高于约85%的乙酰化程 度。
[0039] 此外，本文中的术语"衍生物"涵盖壳聚糖或壳质与其它化合物的反应产物。这种 反应产物包括但不限于羧甲基壳聚糖、羟丁基壳质、N-酰基壳聚糖、0-酰基壳聚糖、N-烷基 壳聚糖、0-烷基壳聚糖、N-亚烷基壳聚糖、0-磺酰基壳聚糖、硫酸化的壳聚糖、磷酸化的壳 聚糖、硝酸化的壳聚糖、碱性的壳质、碱性的壳聚糖，或壳聚糖的金属螯合物等。
[0040] 尽管本发明的第一方面提供了一种用于生产低内毒素的壳聚糖、低内毒素的壳质 或它们的衍生物的方法，但是为了方便和说明的目的，下文仅描述了壳聚糖。
[0041] 壳聚糖可为商购的壳聚糖，诸如食品等级、医用等级或制药等级的壳聚糖。因此， 本发明的方法能够由商购壳聚糖来提供低内毒素的碱性壳聚糖。这就不同于将内毒素移除 或降低作为壳聚糖生产过程的一部分的某些方法。有益地，本发明的方法可用于由制备的 壳聚糖来提供低内毒素的碱性壳聚糖，这些制备的壳聚糖由于其内毒素浓度而不适用于医 用领域。
[0042] 本文中所使用的术语碱性的壳聚糖是指具有大于pH7. 5的pH值的壳聚糖组合物。
[0043] 本文中所使用的术语碱性溶液涉及具有大于pH7. 5的pH值的溶液。
[0044] 由于内毒素的分子量能够显著地变化，所以，内毒素浓度被测量为每克材料中的 内毒素单位（EU)。内毒素浓度的测定是内毒素水平相对于特定量的参比内毒素的量化。
[0045] 例如，在本发明中，内毒素的浓度被测定为每克壳聚糖中的内毒素单位（EU)。本文 中所使用的术语"低内毒素"是指每克壳聚糖中小于50的内毒素单位（EU)的内毒素浓度。
[0046] 因此，本发明的方法适用于生产具有小于50EU/g的内毒素浓度的碱性的壳聚糖。
[0047] 优选地，所得到的碱性的壳聚糖具有小于30EU/g、更优选小于20EU/g、更优选小 于15EU/g、甚至更优选小于10EU/g且最优选小于5EU/g的内毒素浓度。
[0048] 已发现，碱性溶液的低浓度产生了具有所需性质的产物。在本方法中所使用的碱 性溶液的浓度可为0. 2M或更低。优选地，碱性溶液的浓度为约0.0 lM至0. 2M。更优选地，碱 性溶液的浓度为约〇. 02M至0. 1M。碱性溶液的浓度可为约0. 04M至0. 06M，通常为0. 05M。 碱性溶液的浓度可高达约〇. 〇1Μ、0. 05M、0. 10M、0. 15M、0. 20M或0. 25M。使用浓度为0.1 M的 碱性溶液观察到了良好的结果。
[0049] 在一些实施方式中，碱性溶液相对壳聚糖的量可在约1份壳聚糖相对约10份碱性 溶液直至约10份壳聚糖相对1份碱性溶液的范围内。优选地，碱性溶液相对壳聚糖的量为 约1份碱性溶液相对约2份壳聚糖，更优选为约1份碱性溶液相对1份壳聚糖。
[0050] 所述碱性溶液可包括碱金属组分或碱土金属组分，所述碱金属组分或碱土金属组 分选自金属氢氧化物、金属碳酸盐、金属亚硫酸氢盐、金属过硅酸盐、共辄碱和氢氧化铵中 的一种或它们的组合。
[0051] 合适的金属包括钠、钾、钙或镁。
[0052] 优选地，所述碱性组分为氢氧化钠、氢氧化钾或碳酸钠。通常，使用氢氧化钠。
[0053] 可通过本领域已知的任何合适的手段使所述碱性溶液与壳聚糖进行接触。例如， 碱性溶液可被喷涂至壳聚糖或使壳聚糖与碱性溶液进行混合。优选地，存在均匀分布的接 触后的碱性壳聚糖。
[0054] 优选地，使壳聚糖与碱性溶液进行混合。在低分子量时，壳聚糖可完全或部分溶解 在碱性溶液中。在步骤（a)中，壳聚糖可与碱性溶液混合长达约30分钟，更优选约10分钟。 在一些实施方式中，壳聚糖可与碱性溶液混合超过30分钟。
[0055] 在一些实施方式中，壳聚糖在碱性溶液中不溶解。
[0056] 在一些实施方式中，壳聚糖在碱性溶液中不溶胀。
[0057] 在一些实施方式中，碱性溶液润湿壳聚糖，而并不溶解壳聚糖或使壳聚糖溶胀。
[0058] 在一些实施方式中，在步骤（b)的持续时间中，可间歇搅拌壳聚糖和碱性溶液的 混合物。
[0059] 使壳聚糖和碱性溶液的混合物放置使充足的内毒素破坏的时段。使壳聚糖