，完成生物芯片的制造。
[0063]〈在生物芯片上进行神经干细胞的体外培养〉
[0064] 将上述制造的生物芯片依次用蒸馏水、75%酒精、去离子水清洗，以保证通道内部 无材料残余。再经过121°C、20分钟的高压灭菌后将芯片放入60°C恒温箱中烘干。然后将 完全干燥的生物芯片用微量加样器经芯片进液口注入PBS缓冲液清洗3次，以保证微通道 内的液体残余都被PBS置换干净。然后采用多Matrigel基质胶包被芯片，置于37°C恒温箱 中2小时，然后用PBS冲洗3次，再用层粘连蛋白（laminin，LN)包被芯片，然后放入4°C冰 箱过夜备用。
[0065] 本发明所使用的神经干细胞取自于0-3天SD大鼠的脑室下区。使用0.05%的 胰蛋白酶（Trypsin-EDTA)消化神经干细胞制造细胞悬液，然后在lOOOrpm下离心5分钟， 弃掉上清。然后使用SD大鼠神经干细胞培养基重新悬浮细胞，将神经干细胞密度调节至 lX105cells/ml备用。
[0066] 所述SD大鼠神经干细胞培养基（购置于Thermofisher公司）成分如下所示：
[0067]
[0068] 采用已经消毒的医用注射器、内径为0.45mm的毛细管及连接钢制针头将神经干 细胞悬液经生物芯片进液口缓慢注入芯片中，进液量约为1μ1，以进行细胞装载。在显微镜 下观察，确认细胞培养室内，细胞分布均匀。然后，将芯片置于37°C、5% 0)2培养箱中培养， 7小时后观察细胞生长情况，记录细胞生长状况图像。然后，在细胞装载完成之后的第24小 时再进行观测，并再次记录细胞生长状况图像。
[0069] 在细胞培养24小时之后，保证生长良好的情况下进行植入实验。
[0070]〈已经生长良好神经干细胞生物芯片的植入实验〉
[0071]取生长状况健康的成年SD大鼠10只，采用3. 6%的水合氯醛，按照体重lml/100g的配比进行腹部注射方法麻醉。然后对麻醉的SD大鼠进行开颅，在颅骨中外侧打孔，孔径 大小为3. 5mm，打开硬脑膜，将芯片放置于孔内，并保证密封膜一侧朝下，然后使用骨蜡将孔 封闭并缝合手术伤口。正常培养并观察大鼠生理状况。
[0072] 植入生物芯片48小时后将10只大鼠分别处死，取出生物芯片进行显微观察，并记 录显微观察结果。观察结果的数据统计分析结果显示生物芯片内的神经干细胞存活率为 30%。由于正常细胞生长周期细胞会有50%的凋亡率，再加上炎症反应以及其他体内不可 测因素，对于细胞生长均会有不可忽视的影响。因此与传统直接注射神经干细胞的20%的 存活率相比，采用本发明的生物芯片进行移植的干细胞的存活率显著提高。此外，传统培养 最大的问题在于细胞植入与确定位置，且观测细胞生长依靠脑室切片染色难度大。相对于 传统方法，本发明的生物芯片可以在确定位置植入细胞。
[0073] 通过上述描述可知，使用本发明提供的生物芯片，能够提供模拟细胞尤其是神经 干细胞的细胞培养微环境，从而实现细胞尤其是神经干细胞的体外的高密度培养。另外，由 于其具有能够正常进行细胞营养液交换的密封微孔膜，从而能够实现植入细胞与体内细胞 营养基液进行正常交换，保证体外植入的细胞在体内可正常生长分化。进而，密封微孔膜在 保证芯片内部细胞不会漏出的情况下，提供了植入神经干细胞的神经树突与体内神经干细 胞组织进行搭接的通道。因此，使用本发明的生物芯片能够以较低的成本，实现细胞尤其是 神经干细胞的高效可靠地移植。本发明优于传统方式，解决现阶段难题，更是在神经修复及 信息传递方面提出新方法，具有广泛应用价值。
[0074] 需要说明的是，以上所公开实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非意在限制 本发明，本领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明技术方案的宗旨和范围内，可以对本 发明的技术方案进行各种修改或者等同替换，因此这些变形例也涵盖在本发明的权利要求 的包含范围内。
【主权项】
1. 一种生物芯片，其特征在于， 包括细胞培养微结构层和密封微孔膜，所述密封微孔膜覆盖在所述细胞培养微结构层 之上，其中， 所述细胞培养微结构层包括细胞培养室和分别设于所述细胞培养室两侧的进液口及 出液口，所述细胞培养室由多个微结构体排列形成，所述进液口与细胞培养室之间设有进 液通道，所述细胞培养室与出液口之间设有出液通道，使得所述进液口、细胞培养室和出液 口连通。2. 根据权利要求1所述的生物芯片，其特征在于， 所述细胞培养微结构层的材料选自硅、玻璃、石英、聚甲基丙烯酸酯、聚二甲基硅氧烷 中的一种。3. 根据权利要求1所述的生物芯片，其特征在于， 所述进液口、出液口、进液通道、出液通道以及细胞培养室的深度为80μm至150μm。4. 根据权利要求1所述的生物芯片，其特征在于， 所述微结构体为六边形微结构体，该六边形微结构体的尺寸为内接圆直径为10μπι至 40μm、深度为10μ至20μm、六边形微结构体间距为20μm至40μm。5. 根据权利要求1所述的生物芯片，其特征在于， 所述密封微孔膜选自聚醚砜膜（PES)、聚对苯二甲酸乙二醇酯膜（PET)、有机系尼龙 膜、亲水性聚偏氟乙烯膜（PVDF)中的一种。6. 根据权利要求1至5中任一项所述的生物芯片，其特征在于， 所述密封微孔膜的微孔密度为1〇4~10n/cm2,孔径尺寸为8μm至40μm。7. 根据权利要求1至6中任一项所述的生物芯片，其特征在于， 所述生物芯片的厚度为0. 3至0. 7mm、宽度为1至5mm、长度为3至5mm。8. -种生物芯片的制造方法，其特征在于，包括下述步骤： 模具制作步骤，使用超纯水清洗硅片，待未完全干燥时，采用丙酮超声进行清洗，再用 超纯水将硅片上残余液体洗净并用氮气吹干备用，将芯片置于挥发干缸中滴入数滴HDMS 试剂进行修饰之后，将硅片放置于匀胶机正中保持平衡，铺负胶之后，静止规定时间，然后 利用加热的电热板，打开汞灯，启动甩胶机进行甩胶，在真空中停滞规定时间，使硅片中央 恢复平面，接着，将硅片放置于保温箱中，然后打开曝光机进行曝光，并且用用显影液进行 显影； 基片制作步骤，将硅橡胶弹性体和固化剂以体积比10 : 1的比例混合搅拌均匀，将混 合好的硅橡胶弹性体和固化剂在真空干燥箱中脱气，然后倾倒在制作好的阳模模具表面， 烘烤规定时间后取出，待冷却后将固化的聚二甲基硅氧烷剥离，在预定位置打孔分别形成 进液口和出液口，然后切割成规定尺寸，并先后在碱液和酸液中浸泡过夜，用去离子水冲 洗、烘干备用； 密封微孔膜制造步骤，将聚对苯二甲酸乙二醇酯密封微孔膜清洗消毒，在对应于进液 口与出液口处打孔，切割成规定尺寸； 粘合步骤，将已经制造好的细胞培养微结构层、密封微孔膜放置在超净台上，用紫外灯 照射，然后将密封微孔膜覆盖在细胞培养微结构层上，依靠吸附力完成粘合。
【专利摘要】本发明涉及一种生物芯片，包括细胞培养微结构层和密封微孔膜，所述密封微孔膜覆盖在所述细胞培养微结构层之上，其中，所述细胞培养微结构层包括细胞培养室和分别设于所述细胞培养室两侧的进液口及出液口，所述细胞培养室由多个微结构体排列形成，所述进液口与细胞培养室之间设有进液通道，所述细胞培养室与出液口之间设有出液通道，使得所述进液口、细胞培养室和出液口连通。根据本发明，能够提供更加接近于细胞生长小生境的微环境，实现细胞尤其是神经干细胞的体外可控的、高通量的培养。
【IPC分类】A61P25/00, A61K35/30, C12M3/00
【公开号】CN105420105
【申请号】CN201510997994
【发明人】陈涛, 田姗姗
【申请人】北京工业大学
【公开日】2016年3月23日
【申请日】2015年12月25日