(b-FGF，Peprotech公司)，1体积份的非必需氨基酸水溶液(11140，Gibco公司)，10体积份的Knockout FBS血清替代物(10828-028，Gibco公司)，89体积份的a-MEM。
[0091]参考实施例4方法，以相同细胞源、相同密度接种，加15mLTME培养基培养细胞。接种2小时后观察细胞已贴壁，继续培养，接种约4小时后细胞即完全贴壁，更换新鲜TMD培养基;在接种24小时后观察细胞，hUC-MSC呈梭形旋涡状聚集，伸展度高，细胞明亮，汇合度达40-60 % ;接种48小时后观察细胞，hUC-MSC细胞明亮，达90 %以上汇合，胰酶消化收集细胞冻存。
[0092]选择地，细胞达100%汇合后，继续培养后，细胞未卷起脱落，维持长时间良好贴壁。
[0093]细胞形态参见图5。
[0094]将实施例6与实施例1相比较可知，本发明采取TME培养基和TMD培养基进行无血清分步培养，实现了与常规有血清培养的相同结果，但同时又避免了在培养细胞由于引入血清造成传播异种病原体风险，也避免了培养过程中因血清批次差异导致细胞生长过程不稳定的情况。
[0095]实施例7流式细胞仪分析hUC-MSC的表面标志
[0096]取实施例6培养的第3代细胞，待细胞生长至90%汇合后，2mL0.125%胰酶消化，然后在4°C下1200rpm离心6分钟，弃上清收集细胞，PBS清洗两次，将细胞每管1 X 105个转移至流式管，分别加5yL CD34-PE、CD45-FITC、CD29-FITC、CD44-PE、CD73-PE、CD105-PE、CD90-FITC、HLA-ABC-FITC、HLA-DR-PE、I gG 1 -PE (同型对照)和 I gG 1 _FI TC (同型对照)抗体，混匀 4°C下避光孵育30分钟，PBS清洗一次，离心去上清，加500yL PBS缓冲液重悬混匀，上机检测(流式细胞仪XUBeckman公司)，每个样本收集1 X 104个细胞。
[0097]结果参见图6。
[0098]实施例8细胞活力仪分析hUC-MSC的细胞活力、生长特性
[0099]取实施例6培养的第3代细胞接种到T25培养瓶中，待细胞达到95%_100%汇合后，
0.125%胰酶消化，收集细胞以IX 105个/孔密度接种于两个6孔板。待细胞全部贴壁且部分生长10小时后，收集两孔细胞加500yL PBS制成细胞悬液，上机分析(细胞活力分析仪V1-Cell XR，Beckman公司)。此后每12小时取样分析，绘制生长曲线。
[0100]结果参见图7，表明hUC-MSC活性在99.7%以上，细胞直径分布在在9-15μπι，并且具有潜伏期、对数增长期、平台期的增殖特性。
[0101]实施例9hUC-MSC多向分化潜能的鉴定
[0102]1)成骨诱导分化
[0103]取实施例6培养的第3代hUC-MSC以3X104个细胞/cm2接种至6孔细胞培养板，24小时后，每孔添加新鲜配制的人UC MSC成骨诱导分化培养基(HUXUC-90021，赛业产品)2mL，此后每3天更换新鲜的成骨分化诱导培养基，2周后多聚甲醛固定，茜素红染色3-5min。
[0104]结果参见图8A，表明以本发明方法得到的hUC-MSC在成骨诱导两周后，茜素红与成骨过程的钙结节发生深红色显色反应。
[0105]2)成脂诱导分化
[0106]取实施例6培养的第3代hUC-MSC以2X 104个细胞/cm2接种至6孔细胞培养板，待细胞达到100%汇合后，每孔添加成脂诱导分化培养基A液(HUXUC-90031，赛业产品)开始诱导，3天后换成成脂诱导分化培养基B液进行维持24小时，如此循环。当脂滴出现较多但较小时，用成脂诱导液B维持7天，诱导结束后4%多聚甲醛固定，油红0染色。
[0107]结果参见图8B，表明以本发明方法得到的hUC-MSC在成脂诱导两周后，油红0对成脂细胞着色明显。
[0108]实施例10免疫荧光染色分析hUC-MSC特异性蛋白
[0109]取实施例6培养的第5代hUC-MSC以5X 103个细胞每孔的密度接种于24孔细胞培养板，待细胞生长至30%?50%汇合，以4%多聚甲醛固定15分钟后用0.25%TritonX-100打孔处理20分钟，山羊血清封闭后加稀释好的鼠抗人一抗(抗-S0X2抗体、抗-0CT4抗体、抗_NAN0G抗体和抗-NAN0G抗体)，在4°C下过夜避光孵育；之后加FITC标记的山羊抗鼠二抗，在室温下避光孵育2小时;然后以DAPI/PI染核，在室温避光孵育20min，荧光显微镜下观察。
[0110]结果参见图9，表明以本发明方法分步培养的hUC-MSC表达S0X-2、0CT-4、NAN0G以及SSEA-4特异性蛋白。
[0111]以上对本发明【具体实施方式】的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。
【主权项】
1.一种用于分步培养hUC-MSC的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括分开放置的TME培养基和TMD培养基，其中所述TME培养基含有a-MEM、i3-巯基乙醇和非必需氨基酸，所述TMD培养基含有a-MEM/DMEM-F12、i3-巯基乙醇、非必需氨基酸、重组人碱性成纤维生长因子(b-FGF)和血清替代物。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述hUC-MSC为从自然分娩或剖宫产的健康新生儿脐带组织分离出的人脐带间充质干细胞。3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述TME培养基含有0.05-0.2体积份的β-巯基乙醇、0.5-2体积份的非必需氨基酸水溶液和95-100体积份的a-MEM，其中，所述非必需氨基酸水溶液包含浓度各为8_12mM的甘氨酸、丙氨酸、L-天门酰胺、L-天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和丝氨酸； 优选地，所述TME培养基含有0.1体积份的β_巯基乙醇、1体积份的非必需氨基酸水溶液和9 9体积份的a _MEM ； 优选地，所述TME培养基由所述a-MEM、i3-巯基乙醇和非必需氨基酸水溶液组成。4.根据权利要求1至3中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述TMD培养基包含0.Οδ-0.2体积份的β-巯基乙醇、0.5-2体积份的非必需氨基酸水溶液、8-12体积份的血清替代物、85-95体积份的a-MEM/DMEM-F12和终浓度为5-15ng/ml的重组人碱性成纤维生长因子，其中，所述非必需氨基酸水溶液包含浓度各为8_12mM的甘氨酸、丙氨酸、L-天门酰胺、L-天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和丝氨酸； 优选地，所述TMD培养基包含0.1体积份的β-巯基乙醇、1体积份的非必需氨基酸水溶液、10体积份的血清替代物、89体积份的a-MEM/DMEM-Fl 2和终浓度为10ng/ml的重组人碱性成纤维生长因子； 优选地，所述TMD培养基由所述a-MEM/DMEM-Fl 2、β-巯基乙醇、非必需氨基酸水溶液、重组人碱性成纤维生长因子和血清替代物组成。5.使用权利要求1至4中任一项所述的试剂盒分步培养hUC-MSC的方法，其特征在于，所述方法包括:先使用所述试剂盒中的TME培养基培养hUC-MSC，然后使用所述试剂盒中的TMD培养基进行培养。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: (1)将hUC-MSC以0.5-4X 104个细胞/cm2的密度接种于所述试剂盒中的TME培养基中培养3-6小时;细胞在此步骤中进行显著的贴壁； (2)弃去TME培养基，PBS清洗，更换为所述试剂盒中的TMD培养基，每3_5天更换新鲜的TMD培养基;细胞在此步骤中进行显著的扩增； (3)待细胞达70-90%汇合后，收集细胞备用、冻存或重复步骤(1)和(2)传代培养； 可选择地，取步骤(3)收集的hUC-MSC细胞，检测以下项目中的一项或多项:分化能力、细胞活性、细胞纯度、细胞污染和增殖特性。7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: (1)将hUC-MSC以2X 104个细胞/cm2的密度接种于所述试剂盒中的TME培养基中培养3-4小时； (2)弃去TME培养基，PBS清洗1次，更换为预先37°C孵育的所述试剂盒中的TMD培养基，每3天更换新鲜的TMD培养基； (3)待细胞达90%汇合后，收集细胞备用、冻存或重复步骤(1)和(2)传代培养； 可选择地，取步骤(3)收集的hUC-MSC细胞，检测以下项目中的全部:分化能力、细胞活性、细胞纯度、细胞污染和增殖特性。8.通过权利要求5至7中任一项所述的方法获得的hUC-MSC。9.根据权利要求8所述的hUC-MSC，其特征在于，所述hUC-MSC具有以下特征: (1)粘附于塑料培养器皿成梭形旋涡状生长； (2)表达CD29、CD44、CD73、CD90、CD105和HLA-ABC的阳性比例大于99.0%;表达CD45、⑶34和HLA-DR的阳性比例小于1.0% ； (3)体外可诱导分化为成骨细胞和成脂细胞； (4)活细胞检测比率达99%以上； (5)呈典型的“S型”生长曲线特性； (6)多能性基因表达，所述多能性基因为选自SSEA-4、OCT-4、NANOG和SOX-2中的一种或多种。
【专利摘要】本发明公开了一种人脐带间充质干细胞(human？umbilical？cord？mesenchymal？stem？cells，hUC-MSC)无血清培养方案。该方案采用分步法培养hUC-MSC：先使用TME培养基培养3-4小时促进hUC-MSC贴壁，然后更换为TMD培养基进行快速扩增。TME和TMD无血清分步培养法很好地解决了hUC-MSC无血清培养方法中细胞贴壁能力差、增殖缓慢、易分化等问题，为hUC-MSC进行长期稳定的无血清培养技术奠定基础。
【IPC分类】C12N5/0775
【公开号】CN105420187
【申请号】CN201510919391
【发明人】郭镭
【申请人】郭镭, 里程, 圣释（北京）生物工程有限公司
【公开日】2016年3月23日
【申请日】2015年12月11日