用于对全基因组进行快速作图的纳米流体装置以及相关的分析系统和方法
【专利说明】用于对全基因组进行快速作图的纳米流体装置以及相关的分析系统和方法
[0001 ] 相关申请
[0002]本申请要求2013年3月13日提交的美国临时申请序列号61/778,746的优先权，该临时专利申请的内容以参考的方式并入本文中，如同在本文的全文中叙述一样。
_3] 关于联邦政府资助的声明
[0004]本发明是在由美国国立卫生研究院所给予的资助号为HG002647的政府支持下完成。美国政府在本发明中具有某些权利。
技术领域
[0005]本发明涉及多核酸的基因组特征分析。
【背景技术】
[0006]近来，业界对于将纳米尺度部件并入芯片实验室流体装置中已产生相当大的兴趣。该兴趣的起因在于在从微米尺度转变到纳米尺度中的若干优点(和可有利地所实现的差异)。这些差异包括例如:双层重叠(DL0)及其对电渗和电荷选择透过性的影响、电场的局部增强、较高的表面积-体积比、对大的合成和生物聚合物的限制效应、和熵效应的新出现的重要性。参见例如Yuan等人，Electrophoresis(电泳)2007，28，595-610 ； Schoch等人，Rev.Mod.Phys.2008，80，839-883 ；和Kovarik等人，Anal.Chem.2009,81,7133-7140。纳米尺度装置的以往例子包括将多孔介质和凝胶使用于色谱分离和具有纳米尺度孔的滤膜。参见例如Lerman等人，B1polymers，1982,21，995-997；和Tong等人，IVLNano Lett.2004，4，283-287。然而，近来的研究工作集中于用于流体和分析物输送工程几何界限明确的管道以及将它们无缝隙地并入装置中。参见例如Volkmuth等人，Nature 1992，358，600-602 ；和Striemer等人，Nature2007，445，749-753。这种规则结构的优点是在其内部的压力和场梯度、流体流动、和分子运动的相对简单性，相比之下这些特性具有更曲折的网络。例如，限定、表征及容易地建模这些系统的能力可以允许更好地理解分离机制和单分子物理学。参见例如Volkmuth等人，Nature 1992，358，600-602;Reisner等人，Phys.Rev.Lett.2005，94，196101 ；和Salieb-Beugelaar等人，Lab chip，2009，9，2508-2523。
[0007]最近，FIB铣削技术已被描述成用于形成纳米流体装置。参见Menard等人，《在绝缘基材中利用聚焦离子束铣削制作亚5nm纳米通道》，Nano Lett.2011，11，512_517(于2010年12月20日发表)；和于2010年9月21日提交的名称为“用于形成纳米通道的方法、系统和装置”的美国临时专利申请序列号61/384,738(和相关的PCT申请PCT/US2011/052127)，这些文献的内容以参考的方式并入本文中如同在本文的全文中的叙述。除了 FIB铣削外，也可以采用适合于制作纳米通道的多种其它方法，包括例如电子束光刻、纳米压印平板印刷、光亥IJ、模板法或模压成型方案、以及本领域技术人员所了解的其它方法。
[0008]已有人提出了一些纳米流体装置，包括具有用于单分子感测和/或核酸测序的整体式微型电极(纳米或微米尺度)的装置。可替代地，由整个流体部件所构成的整体式装置可以提供对单分子输送和检测的更大控制。参见Menard等人，《一种用于在单个双链DNA分子中执行侧向电导率测量的装置》，六03似1102012，12，9087-9094(于2012年9月5日发表)；2011年9月12日提交(和相应的正在审批的PCT/US13/054128)的名称为“具有与流体感测纳米通道相交的流体输送纳米通道的装置及相关方法”的美国临时专利序列号61/533，523;和2013年2月28日提交的名称为“用于大分子的受控制的捕获、捕集和输送的具有整体式部件的纳米流体装置及相关的分析方法”的美国临时专利序列号61/770,586，这些文献的内容以参考的方式并入本文中如同在本文全文中的叙述。将部件并入到单个整体装置上可以使满足目前在例如DNA测序和医疗诊断领域中的分析需求的新方法和系统成为可能。
【发明内容】
[0009]本发明的实施例提供使染色体DNA的高通量限制性酶切作图简单化的装置。
[0010]本发明的实施例包括纳米流体分析系统。这些系统包括:(a)长度在500μπι和10cm之间并且在检测纳米通道的尺寸相对于反应纳米通道减小的界面位置处合并入检测纳米通道中的反应纳米通道；(b)与反应纳米通道的进入部连接的微流体通道；(c)与微流体通道连接的第一电极；(d)在与反应纳米通道进入部间隔但与其接近的位置从反应纳米通道延伸并且与其流体连通的第一横向流体通道；(e)与第一横向流体通道连接的第二电极；(f)从位于第一横向流体通道下游位置的反应纳米通道延伸并且与其流体连通的第二横向流体通道；(g)与第二横向流体通道连接的第三电极；(h)与检测纳米通道连接的第四电极；
(i)用于控制第一、第二、第三和第四电极的操作从而可控制地在防止片段无序化(例如，使DNA在反应纳米通道中反应从而产生有序片段)的反应纳米通道内部引导、加载和消化DNA的电路;和(j)与构造成空间上且时间上确定片段大小由此能够实时或近实时地生成染色体DNA的有序限制性图谱的检测纳米通道连接的电或光检测器。
[0011 ]微流体通道可以包括构造成部分地堵塞微流体流道的相互间隔的柱的阵列。
[0012]所述系统可以包括将微流体通道与流体输送纳米通道进入部连接的纳米漏斗。
[0013]纳米流体反应通道可以具有含有由“U”形段所连接的多个紧密相隔的大体平行段的蜿蜒形状。
[0014]可以将微流体通道、反应纳米通道、检测纳米通道及第一和第二流体横向通道整体地并入到流体芯片上。
[0015]第一和/或第二横向流体通道可以是具有在大约lnm和大约lOOnm之间的深度、及在大约20nm和大约2000nm之间的宽度的流体纳米通道。
[0016]与检测纳米通道相比，反应纳米通道的长度可以大10和1000倍之间并且深度和/或宽度大2和10倍之间。
[0017]微流体通道可以与一个或多个贮存池流体连通，至少一个贮存池包含用于DNA分析的全细胞。
[0018]用于分析的全细胞可以被用于基因组DNA提取的凝胶基质所限定。
[0019]用于分析的全细胞可以被至少一个高和/或低密度柱阵列限定在微流体通道中，以便于基因组DNA的提取。
[0020]微流体进入通道包含具有DNA的全细胞。第二横向流体通道在远离反应纳米通道的一个端部合并入第二流体贮存池中。第二流体贮存池容纳限制性内切酶和辅助因子的溶液。
[0021]反应纳米通道可以是直的，并且可以具有在大约500μπι至大约2cm之间的长度。与检测纳米通道相比，反应纳米通道的长度大出大约10和大约1000倍之间并且深度和/或宽度大出大约2和大约10倍之间。
[0022]所述系统可包括第二反应纳米通道，该通道与在第二反应纳米通道上的入口端上的流体微通道流体连通并且在第二反应纳米通道的相反的外出端处合并入各自的第二检测纳米通道中。
[0023]其它实施例涉及纳米流体分析芯片。这些芯片包括:(a)适合于利用具有柱阵列的微流体通道从全细胞、细胞核、全染色体或者长DNA分子的其它来源中提取基因组DNA的微流体入口 ；(b)长度在500μηι和10cm之间的反应纳米通道，该反应纳米通道具有连接到微流体入口的进入部；(c)在由纳米通道尺寸减小所限定的交汇处与反应纳米通道的外出端合并的检测纳米通道；(d)从与反应纳米通道的进入部间隔但与其接近的反应纳米通道流体连通的第一横向纳米通道;和(e)从位于第一横向流体纳米通道下游位置的反应纳米通道延伸并且与其流体连通的第二横向流体纳米通道。
[0024]芯片也可包括存在于反应纳米通道和微流体入口之间并且将这两者加以连接的纳米漏斗。
[0025]芯片可以包括多个贮存池，这些贮存池包括与微流体入口流体连通的至少一个贮存池、与第一横向纳米通道流体连通的至少一个贮存池、与第二横向纳米通道流体连通的至少一个贮存池、和与检测纳米通道的一端流体连通的至少一个贮存池。
[0026 ]微流体通道中的柱阵列可以包括轴向地相互间隔的阵列的多个段。
[0027]柱阵列可以构造成大体上延伸跨过微流体通道的整个宽度。
[0028]其它实施例涉及从全细胞、细胞核、全染色体或者长DNA分子的其它来源中生成基因组DNA的有序限制性图谱的方法。这些方法包括:(a)提供一种具有合并入反应纳米通道中的流体微通道的装置，该反应纳米微通道在其中纳米通道直径尺寸减小的界面处合并入检测纳米通道；(b)在微通道中使全细胞溶解并且使具有最小分段的DNA去染色质;然后(c)将完整的DNA分子导入反应纳米通道中；然后(d)在反应纳米通道中利用限制性内切酶将完整的DNA片段化。反应纳米通道的尺寸和构造被设计成使得片段保持原来的顺序直到将它们注入检测纳米通道中。所述方法还包括:(e)在沿检测纳米通道的一个或多个位置检测信号，以便按片段沿长DNA分子的顺序对片段进行作图。
[0029]所述装置可以包括与合并入反应纳米通道中的流体微通道流体连通的至少一个贮存池。可以通过利用贮存池导入用于分析的细胞、细胞核、全染色体、或者长DNA分子的其它来源，而实施导入步骤。所述方法也可以包括提供用于将全细胞固定的凝胶基质和/或高密度柱阵列，然后使细胞溶解，提取出DNA，以及可选地将DNA染色，然后将完整的DNA分子导入反应纳米通道中。
[0030]所述装置可以包括与反应纳米通道的入口端流体连通的具有柱阵列的微流体通道、和与位于微流体通道下游位置的反应通道流体连通的第一横向通道。
[0031]所述方法可以包括:通过将电压施加到微流体和横向通道以便在反应纳米通道的进入区域处产生偏压而引导和加载样品。
[0032]可以利用在接近反应通道入口处的受控制的电压或浓度极化梯度而实施引导步骤，使得最初DNA分子不经受超过DNA拉伸强度的应变并且不发生机械断裂。
[0033]在引导步骤之后，可以通过改变施加到反应纳米通道和横向纳米通道的电压以便以在大约lym/s和大约1mm/ s之间的速率将全部DNA分子拉入反应纳米通道中而实施加载，使得DNA分子的尾端具有充分的时间扩散地从任何柱的缠结分离并且避免机械断裂。
[0034]可以通过改变施加到反应纳米通道和横向纳米通道的电压以便将限制性内切酶和辅助因子导入反应纳米通道中所含有的DNA而实施限制性消化的反应，然后允许反应进行直到所有限制性位点已经被消化。
[0035]施加到反应纳米通道和横向纳米通道的电压可以抑制或防止将限制性内切酶和辅助因子导入微流体通道中并因此防止在反应纳米通道外部的DNA分子的消化。
[0036]可以通过改变施加到反应纳米通道和横向纳米通道的电压以便驱动片段迀移到在反应纳米通道与检测纳米通道之间的界面，而实施有序限制性片段的检测。
[0037]在一些实施例中，可以利用连续施加的恒定电压来实现对限制性片段的引导、加载、限制性消化、和有序检测。
[0038]与反应纳米通道相比，检测纳米通道直径的尺寸可以减小50%至99%之间，由此导致当各片段到达交汇处时输送速率的增加和各相邻片段的分离。然后可以实施检测步骤，以便对经过检测纳米通道的分离片段的输送进行检测。
[0039]可以通过用光学或电学的方法在沿检测纳米通道的一个或多个位置对片段进行检测，而实施检测步骤。
[0040]所述方法可以包括:通过对检测信号的持续时间或积分幅度进行检测而确定片段大小。
[0041 ]所述装置可以是流体分析芯片。
[0042]该芯片可以结合与芯片连接的输送系统而使用，其中输送系统构造成施加电动力学、压力或向心力中的至少一种从而将基因组DNA及其片段经过反应纳米通道输送进入检测纳米通道。
[0043]本发明的其它实施例涉及用于与流体分析芯片相互作用的方法。这些方法包括:(a)控制进样、细胞溶解、及DNA提取和染色；(b)引导DNA并且将所提取的DNA加载入反应纳米通道中，在反应纳米通道中利用限制性内切酶和辅助因子进行限制性消化，和经过检测纳米通道的限制性片段的有序输送；(c)在经过检测纳米通道的输送期间，用电子方法检测限制性片段；(d)实时或近实时地用电子方法分析来自DNA分子的限制性片段大小;和(e)用电子方法从多个DNA分子中生成共有性限制性图谱，并且评定图谱质量以评估是否需要补充的取样。
[0044]本发明的其它方面涉及用于与流体分析芯片相互作用的系统。这些系统包括:(a)用于控制进样、细胞溶解、及DNA提取和染色的装置；(b)用于控制DNA引导和加载入反应纳米通道、在反应纳米通道中使用限制性内切酶和辅助因子的限制性消化、和经过检测纳米通道的限制性片段的有序输送的装置；(c)用于在经过检测纳米通道输送期间检测限制性片段的装置；(c)利用实时或近实时分析对来自DNA分子的限制性片段大小进行分析的装置;和(e)用于从多个DNA分子中生成共有性限制性图谱，并且评定图谱质量以评估是否需要进行补充取样的装置。
[0045]本发明的其它实施例涉及流体分析装置。