新颖的生物标志物的制作方法
【专利说明】新颖的生物标志物
[0001]发明领域 本发明涉及用于预测感染乙型肝炎病毒(HBV)的患者是否将响应干扰素（IFN)疗法的 生物标志物。本发明还涉及使用所述生物标志物预测患者是否将响应IFN疗法的方法和试 剂盒。
[0002] 发明背景 乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的疾病。HBV主要感染在肝中称为肝细胞的细 胞，且当宿主免疫应答试图清除病毒感染时，导致肝损伤。
[0003] 尽管可利用有效的接种和暴露后预防，但是乙型肝炎病毒(HBV)感染依然在全世 界流行，并且其是导致显著的发病率和死亡率的严重的全球性健康问题。如今，超过20亿的 活着的人在他们生命中的某些时候已感染过HBV。世界人口的3/4居住在高水平感染的地 区。每年有超过400万HBV的急性临床病例。
[0004] 尽管大多数患者从急性感染中康复，但是全世界大约3.5亿人(世界人口的5%)遭 受慢性HBV感染。这是经过多年已取得很多进展以理解该疾病的临床病程及全世界已批准 多种疗法的领域。当前疗法的有效性不是100%，而存在许多正在进行的对于新颖疗法的研 究。
[0005] 慢性HBV感染是世界上第十大主要的死亡原因，每年导致100万至120万人的死亡。 大约15%-40%的慢性感染的患者将发展为肝硬化、肝衰竭或肝细胞癌(HCChHCC发生率已在 全世界增加，并且其目前是第五大最频发的癌症，每年导致300，000至500，000例诊断病例。
[0006] 存在8种HBV的病毒基因型(A-H)，且这些在地理分布上不相同（见表1)。多种基因 型可能与疾病的严重性相关联，但是还未建立基因型和HCC的风险之间的关系。
[0007] 表1: HBV基因型和地理分布 来源：乙型肝炎病毒感染的自然历史和临床结果(Natural History and Clinical Consequences of Hepatitis B Virus Infection). C. Pan 和 J. Zhang, Int. J. Med. Sci·， 2005， 2: 36-40。
[0008] 存在多种可利用的HBV治疗，例如干扰素（IFN)疗法。英国国家健康与护理优化研 究所（UK National Institute for Health and Care Excellence ) (NICE)在他们的临 床指南草案中推荐在慢性HBV感染中，应当将聚乙二醇化-干扰素 a_2a疗法作为第一线治 疗来提供。但是，那些接受治疗的患者仅约30%将实际上响应IFN疗法，这导致患者遭受不必 要的副作用之苦并对医疗保健系统施加了财政负担。因此，存在对于预测患者是否将响应 IFN疗法的有效且效率高的方法的需要。
[0009] 发明概述 根据本发明的第一方面，提供了使用CD220作为生物标志物以预测感染乙型肝炎病毒 (HBV)的患者是否将响应干扰素（IFN)疗法。
[0010]根据本发明的另一方面，提供了预测感染乙型肝炎病毒(HBV)的患者是否将响应 干扰素疗法的方法，包括： (a) 从患者获得试验生物样本； (b) 定量本文定义的各生物标志物的量； (c) 将试验生物样本中的各生物标志物的量与存在于从干扰素疗法的一个或更多个应 答者获得的一个或更多个参考样本和/或从干扰素疗法的一个或更多个非应答者获得的一 个或更多个参考样本中的量相比较，以使得 (i) 与来自应答者的参考样本(一个或更多个)相比较，试验生物样本中的各生物标志 物的等同水平;或 (ii) 与来自非应答者的参考样本(一个或更多个)相比较，试验生物样本中的各生物 标志物的水平差异， 指示患者是否将响应干扰素疗法。
[0011] 本发明的另一方面提供配体，例如天然存在的化合物或化学合成的化合物，其能 够特异性结合本发明的生物标志物。根据本发明的配体可包含能够特异性结合该生物标志 物的肽、抗体或其片段、或适配体或寡核苷酸。抗体可为能够特异性结合该生物标志物的单 克隆抗体或其片段。根据本发明的配体可用可检测的标志物标记，例如发光标志物、荧光标 志物或放射性标志物;替代地或另外，根据本发明的配体可用亲和标记物标记，如生物素、 抗生物素蛋白、链霉亲和素或HiS (如6-HiS)标记物。
[0012] 通过本发明还提供如本文描述的一种或更多种配体的用途，所述配体可为天然存 在的或化学合成的，且合适地为肽、抗体或其片段、适配体或寡核苷酸、或能够识别该生物 标志物的任何其它天然化学个体或人工化学个体，或本发明的生物传感器的用途、或本发 明的阵列的用途、或本发明用以检测和/或定量该生物标志物的试剂盒的用途。在这些用途 中，检测和/或定量可在生物样本上进行，所述生物样本例如选自全血、血清、血浆、组织液、 脑脊液(CSF)、滑液、卵泡液、精液、羊水、奶、尿、胸膜液、腹水、支气管肺泡灌洗液、唾液、痰、 眼泪、汗、淋巴液、抽出物(aspirate )、骨髓穿刺液和粘液、或从其中的提取物或纯化物、或 它们的稀释物。
[0013] 提供试剂盒用于实施本发明的方法。此类试剂盒将合适地包含用于本发明的生物 标志物的检测和/或定量的根据本发明的配体、和/或生物传感器、和/或如本文描述的阵 列，任选地与试剂盒的使用说明书在一起。
[0014]因此，根据本发明的另一方面，提供了试剂盒，其包含能够检测和/或定量如本文 定义的各生物标志物的试剂和/或生物传感器，用于预测感染乙型肝炎病毒(HBV)的患者是 否将响应干扰素疗法。
[0015] 附图简述 图1:在HBV e+患者中，IFN应答者相对非应答者中的所选生物标志物的表达。
[0016] 图2:训练集(50%的样本）。对于50%初始训练数据集的应答者和非应答者的sCD表 达的散点图。
[0017] 图3:训练集(完全数据集）。对于包括训练阶段和预测阶段的100%完全数据集的 应答者和非应答者的sCD表达的散点图。
[0018] 发明详述 根据本发明的第一方面，提供了将CD220作为生物标志物以预测感染乙型肝炎病毒 (HBV)的患者是否将响应干扰素（IFN)疗法的用途。
[0019] 在一个实施方式中，所述用途另外包括将⑶295作为又一生物标志物。
[0020] 在另一实施方式中，所述用途另外包括将⑶62LXD152、⑶W329和/或⑶80作为另 外的生物标志物。在又一实施方式中，所述用途另外包括将⑶66a和⑶217b/r作为另外的生 物标志物。
[0021] 根据本发明的替代的方面，提供了将CD295作为生物标志物以预测感染乙型肝炎 病毒(HBV)的患者是否将响应干扰素（IFN)疗法的用途。
[0022]根据本发明的另一方面，提供了将⑶220和⑶295作为一组特异性生物标志物以预 测感染乙型肝炎病毒(HBV)的患者是否将响应干扰素（IFN)疗法的用途。
[0023] 术语"生物标志物"指方法、事件或状况的区别性生物指示剂或生物学上获得的指 示剂。具体而言，本发明的生物标志物用于鉴别最有可能响应具体治疗性治疗的患者。生物 标志物也可用于诊断方法中，如临床筛选和预后评估，及用于监测治疗的结果、药物筛选和 开发。生物标志物及其用途对于新药治疗的鉴定和对于用于药物治疗的新靶的发现是有价 值的。在一个实施方式中，如本文定义的生物标志物在体外使用。
[0024] 本文提及"CD"或"分化群"指存在于白细胞和其它组织类型上的细胞表面蛋白。在 本发明的上下文中，术语"CD"指由给定的单克隆抗体或特异性地'簇聚'至考虑中的抗原/ 分子的单克隆抗体组或多克隆抗体组或多克隆抗体识别的细胞表面白细胞分子。
[0025]应当注意的是⑶220也可称作"胰岛素受体"。⑶295也可称作"瘦蛋白受体"。
[0026]若患者在使用IFN治疗之后具有持续的应答，则认为他们"响应"了IFN疗法。干扰 素意欲通过以下两种机理来治疗感染HBV的患者:第一，IFN抑制病毒DNA的合成，因而具有 直接的抗病毒效应;和第二，IFN通过刺激天然杀伤细胞和辅助性T细胞来指导患者对于受 感染的肝细胞的免疫应答（见Asselah等人的Clinics in Liver Disease, 11 (2007) 839-849)。因此，IFN疗法引起HBV复制的减少(通过血清中的HBV DNA的减少来指示）。
[0027]具体而言，对于疗法的应答可定义为血清中不可检测的HBV DNA(例如小于105拷 贝/mL)、伴随或不伴随抗-HBe检测的HBV "e"抗原（HBeAg)的持续损失(HBeAg血清转变）、 ALT(丙氨酸转氨酶)的正常化和肝坏死性炎症或肝纤维化的减少。
[0028] 使用本文定义的生物标志物将能够鉴定哪个患者将成功地响应干扰素疗法。这将 节省在非应答患者中进行无用的IFN疗法的成本和用于处理IFN副作用的相关成本。
[0029] 对于患者的优势将源自个性化的治疗方法、更好的临床结果和更好的依从性。对 于医务人员，它将是用以更好地使治疗适应个体患者需求和用以帮助长期监测的非常有用 的工具。对于医疗保健系统本身，将存在显著的节省，因为昂贵的IFN治疗将为最有可能具 有持续应答的患者储备。
[0030] 在一个实施方式中，生物标志物是可溶性⑶（s⑶）。
[0031] 很多(若非全部)CD分子产生可溶形式，其通过可变剪接、蛋白酶剪切、解离或其它 机理从分子表面释放。因此，在本发明的上下文中，术语sCD(即可溶性CD分子）与术语分泌 性CD或可溶性CD或脱落性(shed) CD (sCD)同义，并指典型地被发现在细胞表面表达的白 细胞分子的释放形式，且其中至少一部分的该分子被如本文描述的给定单克隆抗体或单克 隆抗体组或多克隆抗体识别。但是，应当注意的是，用于识别该CD分子的抗体可能不是天然 存在的单克隆抗体或多克隆抗体。其可能是工程改造的、由从具有完整识别的抗体分子获 得的表达片段组成的人工构建物，或其可能是非蛋白分子识别剂或蛋白识别剂，其不是抗 体，或是抗体混合物，例如通过将抗体结合部位引入不同的支架中制备的。
[0032] 有利地，如在W0 03/075016中所定义的，s⑶的可溶形式通过各种机理生成，所述 机理包括但不限于选自以下的那些中的任何一种:可变剪接、蛋白酶剪切和解离。
[0033]已显示sCD在血液中的模式看来似乎与具体的疾病存在相关联。这导致这样的观 点：sCD抗原生物标志物的模式可用作用于疾病诊断和监测的通用化系统的基础。很多CD抗