用于治疗目的的工程改造的灵长类动物l-甲硫氨酸酶的制作方法
【专利说明】用于治疗目的的工程改造的灵长类动物L-甲硫氨酸酶
[0001] 发明背景
[0002] 本申请要求2013年8月29日提交的美国临时申请号61/871，768的优先权权益，所 述临时申请的完整内容W引用的方式并入本文。
[0003] 本发明在政府支持下根据由美国国立卫生研究院授权的授权号R01CA154754进 行。政府对本发明享有某些权利。
[0004] 1.发明领域
[0005] 本发明大体来说设及医学和生物学的领域。更具体说来，其设及用于癌症治疗的 改进的人类甲硫氨酸-丫-裂解酶化MGL)。
[0006] 2.相关技术的描述
[0007] 对必需氨基酸k甲硫氨酸的需求在癌组织中特别高。甲硫氨酸缺乏已经显示有效 杀死各种肿瘤类型，而不会不利地影响非癌组织。甲硫氨酸缺乏可经由水解所述氨基酸的 酶的作用实现。虽然人类甲硫氨酸缺乏酶先前不存在，但来自绿脈杆菌的细菌酶甲硫氨酸-丫-裂解酶显示在临床上治疗有效并且已经在临床试验中加 W评估。然而，作为细菌蛋白的 甲硫氨酸-γ -裂解酶为高度免疫原性的，从而引发特异性抗体的形成，导致不利反应并且 还导致降低的活性。甲硫氨酸-丫-裂解酶还具有仅约化的极短的体外和体内半衰期，迫使 极频繁并且虚高给药W实现全身性缺乏。
[000引全身性甲硫氨酸缺乏为大量研究的焦点并且具有治疗癌症的潜力，所述癌症尤其 如转移性乳癌、前列腺、神经母细胞瘤和膜腺癌。尽管因运种治疗性方法而非常激动，但所 述细菌源性甲硫氨酸-丫-裂解酶具有严重缺陷（免疫原性和血清中的快速失活，如上文所 讨论），所述缺陷极大地阻碍将其用作化学治疗剂的积极性。
[0009]先前，通过将Ξ种关键的氨基酸取代引入人类酶脫硫酸-丫-裂解酶(C化）中来产 生工程改造的人类甲硫氨酸-丫-裂解酶化MGレ化V):E59N、R119L、E339V。参见美国专利号 8,709,407，其^引用的方式并入本文。不同于基本上不展示针对心甲硫氨酸的催化活性的 原生CGL，所述E59N、R11化、E339V变体酶化MGk^V)展示体内和体外强烈的心甲硫氨酸降 解活性。然而，仍需要开发具有较高催化活性的人类心甲硫氨酸降解酶，使得可用所述酶的 较低给药和/或不太频繁施用来获得治疗效应。
[001日]发明概述
[00川本文提供具有高于hM化-NLV的催化活性的人类甲硫氨酸-丫-裂解酶化MGU突变 体。优选的改进hMGL蛋白展现6-10倍高的活性。归因于较高的催化活性，所提供的hMGL蛋白 可针对甲硫氨酸缺乏展示较高的治疗效力并且因此患者的给药可需要较低浓度的治疗剂。 运种酶通过将氨基酸取代引入人类酶脫硫酸-丫 -裂解酶(CGL)中包含残基E59、R119或E339 的位置处来工程改造。在一个特定实施方案中，hC(；L中E59、R119和E339的优选取代分别包 括心天冬酷胺(位置59处）、k白氨酸(位置119处)和心鄉氨酸(位置339处）。本发明公开相 对于hMGL-NLV变体展示较高催化活性的相关组合物。运些组合物相比于hMGL-NLV变体至少 在鉴定为对赋予心甲硫氨酸-丫-裂解酶活性至关重要的E59、R119或E339位置中的两者处 含有取代。运些变体的较高催化活性是重要的，因为患者的给药可需要较低浓度的治疗剂。
[0012] 所述具有额外氨基酸取代的变体包括SEQ ID N0:3，hC化-E59N-S63L-L91M-R11化-K268R-T311G-E339V-I353S化CGk8mut-l); SEQ ID NO:4，hCGkE59I-S63kL91M-R11化-K268R-T311G-E339V-I353S化CGk8mut-2); SEQ ID NO: 5，hCGkE59N-S63kL91M-R119A-K268R-T311G-E339V-I353S化CGk8mut-3);和沈Q ID N0:6，hCGkE59I-S6化-L91M-R119A-K268R-T311G-E339V-I353S化C Gk8mut-4)。
[0013] 本发明的某些方面通过提供包含具有甲硫氨酸-丫-裂解酶(MGL)活性的人类多肤 序列的改进酶克服了所属领域中的严重缺乏，所述酶可适用于癌症疗法并且具有低免疫原 性、改进的血清稳定性和改进的催化活性。因此，在第一实施方案中，提供一种经修饰多肤 (即，酶），尤其是具有源于与MGL相关的灵长类动物酶的甲硫氨酸降解活性的酶变体。例如， 所述新颖的酶变体可具有选自由SEQ ID N0:3-6组成的群组的氨基酸序列。具体说来，所述 变体可源于人类酶，如人类脫硫酸-丫 -裂解酶(C化）。在某些方面，可存在包含能够降解甲 硫氨酸的经修饰人类C(iL的多肤。在一些实施方案中，所述多肤可能够在生理条件下降解甲 硫氨酸。例如，所述多肤可具有至少或约0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、 0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、 800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、104、105、106m-1s-i 或可在所 述范围中派生的任何范围的关于甲硫氨酸的催化效率化cat/KM)。在其他方面，所述多肤可 展示多达 100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、 4、3、2、l、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001M-is_i 或可在 所述范围中派生的任何范围的ksat/KM的针对心高脫氨酸的催化活性。
[0014] 如上文所讨论的经修饰多肤可表征为如与未修饰多肤(例如，原生多肤)或本文所 公开的任何多肤序列相比具有特定百分比的同一性。例如，所述未修饰多肤可包含原生灵 长类动物脫硫酸酶（即，脫硫酸-丫 -裂解酶）的至少或多达约10、20、30、40、50、60、70、80、 90、100、150、200、250、300、350、400个残基(或可在所述范围中派生的任何范围）。所述同一 性百分比可在经修饰多肤的未修饰部分（即，经修饰多肤中排除在氨基酸位置59、63、91、 119、268、311、339和/或353处的任何取代的序列）与原生多肤之间为约、至多或至少50%、 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% (或可 在所述范围中派生的任何范围）。还预期如与多肤的未修饰区相比，上文所讨论的同一性百 分比可与多肤的特定修饰区有关。例如，多肤可含有脫硫酸酶的经修饰或突变型底物识别 位点，所述位点可基于脫硫酸酶的经修饰或突变型底物识别位点的氨基酸序列与来自相同 物种或跨所述物种的未修饰或突变型脫硫酸酶的所述氨基酸序列的同一性来表征。表征为 例如与未修饰脫硫酸酶具有至少90%同一性的经修饰或突变型人类多肤意指在所述经修 饰或突变型人类多肤中的至少90%的氨基酸与未修饰多肤中的氨基酸同一。
[0015] 所述未修饰多肤可为原生脫硫酸酶，尤其人类亚型或其他灵长类动物亚型。例如， 所述原生人类脫硫酸酶可具有SEQ ID NO: 1的序列。其他原生灵长类动物脫硫酸酶的非限 制性实例包括苏口答腊猩猩脫硫酸酶(Genbank ID:NP_001124635.1;SEQ ID N0:7)、食蟹 猴脫硫酸酶（Genbank ID:AAW71993.1;SEQ ID N0:8)、黑猩猩脫硫酸酶（Genbank ID:XP_ 513486.2;沈9 10^:9)和倭黑猩猩脫硫酸酶(66扣日证10:乂?_003830652.1;沈9 10^: 10)。示例性原生多肤包括具有SEQ ID NO: 1或7-10或其片段的约、至多或至少50%、55%、 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 同一性(或可 在所述范围中派生的任何范围）的序列。例如，所述原生多肤可包含SEQ ID NO: 1或7-10的 序列的至少或多达约 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、415 个残基(或可在所述范围中派生的任何范围）。
[0016] 在一些实施方案中，所述原生OiL可通过一种或多种其他修饰，如化学修饰、取代、 插入、缺失和/或截短来修饰。例如，所述修饰可位于所述原生酶的底物识别位点处。在一个 特定实施方案中，所述原生C(iL可通过取代修饰。例如，取代的数目可为4、5、6、7或更大。在 其他实施方案中，所述原生C(iL可在底物识别位点或可影响底物特异性的任何位置中经修 饰。例如，经修饰多肤可在对应于沈Q ID N0:1的E59、S63、L91、R119、K268、T311、E33^P/^S^ 1353的氨基酸位置或灵长类动物OiL的59、63、91、119、268、311、339和/或353的氨基酸位置 处具有至少一种氨基酸取代。例如，所述灵长类动物可为人类、苏口答腊猩猩、食蟹猴、黑猩 猩或倭黑猩猩。
[0017] 在某些实施方案中，在氨基酸位置59、63、91、119、268、311、339和/或353处的取代 为天冬氨酸(N)、鄉氨酸(V)、白氨酸化）、甲硫氨酸(M)、精氨酸(R)、甘氨酸(G)、丙氨酸(A)或 丝氨酸（S)。在一个特定实施方案中，所述修饰为选自由E59N、E59I、S6：3L、L91M、R119L、 1?1194、1(2681?、了3116、6339￥和13535组成的群组的一种或多种修饰。在另一实施方案中，所 述取代可包含S6化、1^9謹、1(2681?、了3116、6339￥和13535取代。在另一实施方案中，所述取代 可包含E59N或E59I和R11化或R119A的额外取代。
[001引在一些实施方案中，所述原生OiL可为人类CGL。在一个特定实施方案中，所述取代 为人类C化的E59N、S63L、L91M、R11化、K268R、T311G、I353S和E339V的组合（例如，所述经修 饰多肤具有SEQ ID ^):3的氨基酸序列、其片段或同系物）、人类0；1的6591、5631^、1^9謹、 1?11化、1(2681?、了3116、13535、6339￥的组合（例如，所述经修饰多肤具有沈9 10^:4的氨基 酸序列、其片段或同系物）、人类 C 化的 E59N、S63L、L91M、R119A、K268R、T311G、I353S和E339V 的组合(例如，所述经修饰多肤具有SEQ ID N0:5的氨基酸序列、其片段或同系物）或人类 C化的E59I、S6：3L、L91M、R119A、K268R、T311G、I353巧此339V的组合（例ク日，所述经修饰多肤 具有SEQ ID N0:6的氨基酸序列、其片段或同系物）。在另一实施方案中，所述经修饰多肤可 为苏口答腊猩猩CGkNLMLRGSV突变体(SEQ ID NO: 11)、苏口答腊猩猩CGkILMLRGSV突变体 (569 10^:12)、苏口答腊猩猩〔61^-化]^1?；5￥突变体(569 10^:13)、苏口答腊猩猩〔61^-化]^1?65￥突变体（569 10腸：14)、食蟹猴〔6心化亂1?65￥突变体（569 10腸：15)、食蟹猴 〔6心1〇111?；5￥突变体(569 10側：16)、食蟹猴〔6心化]^1?；5￥突变体(569 10側：17)、食蟹 猴〔6心比]^1?；5￥突变体（569 10^:18)、黑猩猩〔6心化肥1?65￥突变体(569 10^:19)、黑 猩猩CGkILMLRGSV突变体(SEQ ID N0:20)、黑猩猩CGkNLMARGSV突变体（SEQ ID N0:21)、 黑猩猩〔6心比]^1?；5￥突变体（569 10顯:22)、倭黑猩猩〔6心化肥1?；5￥突变体（569 10顯： 23)、倭黑猩猩CGkILMLRGSV突变体（SEQ ID顯：24)、倭黑猩猩〔6心化]^1?；5￥突变体（569 10^:25)或倭黑猩猩〔6心比魁365￥突变体(569 10^:26)。
[0019] 在一些方面，本发明还预期包含连接于异源氨基酸序列的经修饰C化的多肤。例 如，所述经修饰OiL可连接于所述异源氨基酸序列作为融合蛋白。在一个特定实施方案中， 所述经修饰C化可连接于氨基酸序列，如IgG Fc、白蛋白、白蛋白结合肤或XTEN多肤用于增 加体内半衰期。
[0020] 为了增加血清稳定性，所述经修饰OiL可连接于一个或多个聚酸分子。在一个特定 实施方案中，所述聚酸可为聚乙二醇(PEG)。所述经修饰多肤可经由特异性氨基酸残基，如 赖氨酸或半脫氨酸连接于PEG。关于治疗性施用，所述包含所述经修饰OiL的多肤可分散于 药学上可接受的载体中。
[0021] 在一些方面，涵盖编码所述经修饰OiL的核酸。在一些实施方案中，所述核酸已经 针对细菌中的表达进行密码子优化。在特定实施方案中，所述细菌为大肠杆菌。在其他方 面，所述核酸已经针对真菌(例如酵母）、昆虫或哺乳动物中的表达进行密码子优化。本发明 进一步涵盖含有所述核酸的载体，如表达载体。在特定实施方案中，所述编码所述经修饰 C(iL的核酸可操作地连接于启动子，包括但不限于异源启动子。在一个实施方案中，经修饰 C化可通过载体(例如基因疗法载体)递送至祀细胞。所述病毒可已经通过重组DNA技术修饰 W使经修饰CGL编码核酸能够在祀细胞中表达。运些载体可来源于非病毒(例如质粒)或病 毒(例如腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、慢病毒、瘤疹病毒或牛痘病毒)起源的载体。非病 毒载体优选地与试剂复合W促进DNA跨细胞膜的进入。所述非病毒载体复合物的实例包括 与聚阳离子试剂的配制物，所述聚阳离子试剂促进DNA和基于脂质的递送系统的缩合。基于 脂质的递送系统的实例将包括核酸的基于脂质体的递送。
[0022] 在其他方面，本发明进一步涵盖包含所述载体的宿主细胞。所述宿主细胞可为细 菌(例如大肠杆菌）、真菌细胞(例如酵母）、昆虫细胞或哺乳动物细胞。为了进一步区分具有 甲硫氨酸降解活性的所需C化突变体与原生CGL，可制备具有ilvA和metA的缺失的宿主细胞 (例如大肠杆菌ilvAmetAl并且用于鉴定所需突变体。
[0023] 在一些实施方案中，将所述载体引入至用于表达经修饰OiL的宿主细胞中。所述蛋 白可W任何适合方式表达。在一个实施方案中，所述蛋白在宿主细胞中表达，使得所述蛋白 糖基化。在另一实施方案中，所述蛋白在宿主细胞中表达，使得所述蛋白非糖基化。
[0024] 本发明的某些方面还涵盖通过施用经修饰OiL肤、基因疗法载体中编码经修饰CGL 的核酸或本发明的配制物进行治疗的方法，并且具体说来治疗肿瘤细胞或具有癌症的受试 者的方法。所述受试者可为任何动物，如小鼠。例如，所述受试者可为哺乳动物，具体说来灵 长类动物，并且更具体说来人类患者。在一些实施方案中，所述方法可包括选择具有癌症的 患者。在某些方面，所述受试者或患者可维持甲硫氨酸限制饮食或正常饮食。
[0025] 在一些实施方案中，所述癌症为对甲硫氨酸缺乏敏感的任何癌症。在一个实施方 案中，本发明涵盖一种治疗肿瘤细胞或癌症患者的方法，所述方法包括施用包含所述多肤 的配制物。在一些实施方案中，所述施用在一定条件下发生，使得所述癌症的至少一部分细 胞被杀死。在另一实施方案中，所述配制物包含在生理条件下具有甲硫氨酸降解活性并且 进一步包含所连接的聚乙二醇链的所述经修饰CGL。在一些实施方案中，所述配制物为包含 上文所讨论的C(iL变体中的任一者和药学上可接受的赋形剂的药物配制物。所述药学上可 接受的赋形剂是所属领域的技术人员众所周知的。所有W上C(iL变体均可预期适用于人类 疗法。
[0026] 在另一实施方案中，也可提供一种治疗肿瘤细胞的方法，所述方法包括施用包含 具有甲硫氨酸降解活性的非细菌(哺乳动物，例如灵长类动物或小鼠）经修饰CGL或编码其 的核酸的配制物。
[0027] 因为肿瘤细胞依赖于其关于甲硫氨酸的营养培养基，所W所述施用或治疗可针对 用于所述细胞的营养源，并且不必要针对所述细胞本身。因此，在体内应用中，治疗肿瘤细 胞包括使用于肿瘤细胞的群体的营养培养基与工程改造的甲硫氨酸酶接触。在运个实施方 案中，所述培养基可为血液、淋己液、脊髓液和其中需要甲硫氨酸缺乏的类似体液。
[0028] 根据本发明的某些方面，含有工程改造的甲硫氨酸酶的所述配制物可静脉内、皮 内、动脉内、腹膜内、病灶内、烦内、关节内、前列腺内、胸膜内、滑膜内、气管内、鼻内、玻璃体 内、阴道内、直肠内、肿瘤内、肌肉内、皮下、结膜下、囊内、经粘膜、屯、包内、厮带内、眼内、经 口、经表面、通过吸入、输注、持续输注、局部灌注、经由导管、经由灌洗在脂质组合物（例如 脂质体)中或通过如所属领域的技术人员将知道的其他方法或前述的任何组合施用。
[0029] 在另一实施方案中，所述方法也可包括向所述受试者施用至少一种第二抗癌疗 法。所述第二抗癌疗法可为手术疗法、化学疗法、放射疗法、冷冻疗法、激素疗法、免疫疗法 或细胞因子疗法。
[0030] 在一个实施方案中，提供一种包含工程改造的甲硫氨酸酶或编码工程改造的甲硫 氨酸酶的核酸的组合物，用于治疗受试者中的肿瘤。在另一实施方案中，提供工程改造的甲 硫氨酸酶或编码工程改造的甲硫氨酸酶的核酸的用途，其用于制造用于治疗肿瘤的药剂。 所述工程改造的甲硫氨酸酶可为所述实施方案的任何工程改造的甲硫氨酸酶。
[0031] 在本发明的方法和/或组合物的上下文中讨论的实施方案可关于本文所述的任何 其他方法或组合物使用。因此，关于一种方法或组合物的实施方案也可应用于本发明的其 他方法和组合物。
[0032] 如本文所用，关于核酸的术语"编码(encode)"或"编码(encoding)"用于使本发明 可容易地由熟练技术人员了解；然而，运些术语可分别与"包含（comprise)"或"包含 (comprising)"互换使用。
[0033] 如本文说明书中所用，"一(a)"或"一(an)"可意指一种或多种。如本文权利要求书 中所用，当联合措辞"包含(comprising)"使用时，措辞"一 (a)"或"一 (an)"可意指一种或超 过一种。
[0034] 除非明确指示为仅指代替代物或所述替代物互相排除，否则在权利要求书中术语 "或"的使用是用于意指"和/或"，不过本公开支持仅指代替代物和"和/或"的定义。如本文 所用，"另一"可意指至少第二种或更多种。
[0035] 在本申请中，术语"约"用于指示一个值包括针对用于确定所述值的器件、方法的 固有误差变化，或在研究受试者之间存在的变化。
[0036] 本发明的其他目标、特征W及优点将根据W下详细描述变得显而易知。然而，应了 解所述详细描述和具体实施例虽然指示本发明的优选实施方案，但仅W说明的方式给出， 因为在本发明的精神和范围内的各种改变和修改根据运个详细描述对于所属领域技术人 员将变得显而易知。
[0037] 附图简述
[0038] W下图式形成本说明书的一部分并且包括在内W进一步证明本发明的某些方面。 本发明可通过与本文提供的具体实施方案的详细描述组合参考运些图式中的一个或多个 来更好地理解。
[0039] 图1-hCGL与hCGk8mut-1-4的序列比对。突出显示的残基指示突变型残基和其位 置。hC化二沈Q ID N0:l;hCGl^-8mut-l =沈Q ID N0:3;hCGk8mut-2 =沈Q ID N0:4;hCGl^-8111111-3 =沈9 10備：5;并且}1〔6心8111111-4 =沈9 10備：6。
[0040] 图2-用hC化-8mut-l的滴定治疗的前列腺肿瘤细胞系PC3(空屯、圆）和DU145(实屯、 正方形)上的效应，分别导致0.25ιχΜ和0.2 liiM的表观IC50值。
[0041 ]图3-在37°C下在汇集的人类血清中解育的PEG化hCGk8mut-l随时间而变的活性： 表观 Το. 5 = 1