i con)缓冲液交换至1 OOmM化P〇4缓冲液(pH 8.3) 中。随后，添加 lOmM的浓度的PLP并且所述蛋白在25°C下解育化。甲氧基阳G班巧酷亚胺簇基 甲醋5000MW(JenKem Technology)接着W80:1摩尔比添加至hCGl^-8mut-l中并且允许在25 °0下在恒定揽拌下反应化。所得混合物使用100,000MWC0过滤器件(Amicon)广泛地进行缓 冲液交换（具有10%甘油的PBS)，并且用0.2微米针筒过滤器（VWR)灭菌。使用Limulus Ameboc}fte Lysate化AL)试剂盒（Cape Cod Incorporated)分析所有PEG化酶的脂多糖 (LPS)含量。
[0224] 实施例8-PEG化hCGk8mut-l的血清稳定性
[02巧]PEG化hCGk8mut-l的血清稳定性通过使所述酶在汇集的人类血清中在37°C下W ΙΟμΜ的最终浓度解育来测试。在不同时间点处，抽取等分试样并且使用如美国专利公布 2011/0200576中所述的DTNB测定测试活性，所述公布W全文引用的方式并入本文。在对数 据绘制曲线后，PEG化hCGk8mut-l经计算具有101 ± 4h的半衰期(To. 5)(图3)。
[0226] 实施例9-小鼠中PEG化hCGk8mut-l的药效学分析
[0227] 为了分析上文实施例4-7中所公开的工程改造的人类甲硫氨酸降解酶在小鼠模型 中清除k甲硫氨酸的功效，通过尾静脉注射向Ξ组的各Ξ只动物施用50mg/kg阳G-hCGk 8mut-l，同时维持正常饮食。各组在对应于8、24和4甜的时间点处通过屯、脏静脉穿刺处死W 用于血清收集。血清样品接着相继通过用邻苯二醒(0PA)衍生化、高效液相色谱化PLC)分析 k甲硫氨酸含量，基本上如Agilent Technologi es所述（在万维网chem.agilent.com/ 1化'日巧/(1日1日3116613/化131;[。/5980-3088.?0。上）。运种使用阳6-11〔61^-81]1111：-1的给药方案 使得心甲硫氨酸能够经1化缺乏至低于扣Μ的水平（图4)。相比之下，向正常饮食的小鼠施用 200mg/kg所述阳G化hCGkNLV仅降低血清k甲硫氨酸至约ΙΟμΜ持续地(图5)。
[022引 ***
[0229] 本文所公开并且要求的所有方法均可根据本发明进行并且实施而无需不当实验。 虽然本发明的组合物和方法已经就优选的实施方案加 W描述，但本领域技术人员应显而易 知，变化可应用于所述方法和本文所述方法的步骤中或步骤序列中而不偏离本发明的概 念、精神W及范围。更具体说来，应显而易知在化学上并且在生理学上相关的某些试剂可取 代本文所述的试剂，同时将实现相同或相似结果。本领域技术人员显而易知的所有所述相 似的取代物和修饰均被视为在随附权利要求书所界定的本发明的精神、范围W及概念内。
[0230] 参考文献
[0231] W下参考文献特定地W引用的方式并入本文，其并入程度使其提供补充本文所陈 述的内容的示例性程序或其他详情。
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【主权项】
1. 一种分离的经修饰灵长类动物胱硫醚-γ-裂解酶(CGL)，其相对于原生灵长类动物 CGL氨基酸序列（参见SEQ ID NO: 1和7-10)具有至少一种取代，所述至少一种取代包括在所 述原生灵长类动物CGL序列的位置59、63、91、119、268、331、339和/或353处的取代，其中所 述至少一种取代不可仅为位置59处的Val、位置59处的Asn、位置119处的Leu和/或位置339 处的Val。2. 如权利要求1所述的酶，其中所述至少一种取代包括i)位置59处的Asn或lie，ii)位 置63处的Leu，iii)位置91处的Met，iv)位置119处的Leu或Ala，v)位置268处的Arg，vi)位置 311处的Gly，vii)位置339处的Val和/或viii)位置353处的Ser。3. 如权利要求1所述的酶，其中所述至少一种取代包括位置63处的Leu、位置91处的 Met、位置268处的Arg、位置311处的Gly、位置339处的Val和位置353处的Ser。4. 如权利要求3所述的酶，其进一步包含位置59处的Asn或lie和位置119处的Leu或 Ala〇5. 如权利要求4所述的酶，其中所述至少一种取代包括位置59处的Asn、位置63处的 Leu、位置91处的Met、位置119处的Leu、位置268处的Arg、位置311处的Gly、位置339处的Val 和位置353处的Ser。6. 如权利要求4所述的酶，其中所述至少一种取代包括位置59处的lie、位置63处的 Leu、位置91处的Met、位置119处的Leu、位置268处的Arg、位置311处的Gly、位置339处的Val 和位置353处的Ser。7. 如权利要求4所述的酶，其中所述至少一种取代包括位置59处的Asn、位置63处的 Leu、位置91处的Met、位置119处的Ala、位置268处的Arg、位置311处的Gly、位置339处的Val 和位置353处的Ser。8. 如权利要求4所述的酶，其中所述至少一种取代包括位置59处的lie、位置63处的 Leu、位置91处的Met、位置119处的Ala、位置268处的Arg、位置311处的Gly、位置339处的Val 和位置353处的Ser。9. 如权利要求1所述的酶，其进一步包含异源肽区段。10. 如权利要求9所述的酶，其中所述异源肽区段为XTEN肽、IgG Fc、白蛋白或白蛋白结 合肽。11. 如权利要求1所述的酶，其中所述酶偶联到聚乙二醇(PEG)。12. 如权利要求11所述的酶，其中所述酶经由一个或多个Lys或Cys残基偶联到PEG。13. -种核酸，其包含编码如权利要求1所述的酶的核苷酸序列。14. 如权利要求13所述的核酸，其中所述核酸针对细菌、真菌、昆虫或哺乳动物中的表 达进行密码子优化。15. -种包含如权利要求14所述的核酸的表达载体。16. -种包含如权利要求14所述的核酸的宿主细胞。17. 如权利要求16所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为细菌细胞、真菌细胞、昆虫细 胞或哺乳动物细胞。18. 如权利要求17所述的宿主细胞，其中所述细菌细胞为具有基因 ilvA和metA的缺失 的大肠杆菌菌株。19. 一种药物配制物，其包含在药学上可接受的载体中的如权利要求1所述的酶或如权 利要求13所述的核酸。20. -种治疗肿瘤细胞或具有肿瘤细胞的受试者的方法，其包括向所述肿瘤细胞或所 述受试者施用如权利要求19所述的配制物。21. 如权利要求20所述的方法，其中所述受试者维持甲硫氨酸限制饮食。22. 如权利要求20所述的方法，其中所述受试者维持正常饮食。23. 如权利要求20所述的方法，其中所述受试者为人类患者。24. 如权利要求20所述的方法，其中所述配制物静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病灶内、 颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、眼内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、肌肉内、皮 下、结膜下、囊内、经粘膜、心包内、脐带内、经口、通过吸入、通过注射、通过输注、通过持续 输注、通过直接洗刷靶细胞的局部灌注、经由导管或经由灌洗施用。25. 如权利要求20所述的方法，其中所述配制物施用于所述肿瘤细胞的营养培养基中。26. 如权利要求25所述的方法，其中所述营养培养基为血液、淋巴液或脊髓液。27. 如权利要求20所述的方法，其进一步包括向所述受试者施用至少一种第二抗癌疗 法。28. 如权利要求27所述的方法，其中所述第二抗癌疗法为手术疗法、化学疗法、放射疗 法、冷冻疗法、激素疗法、免疫疗法或细胞因子疗法。29. -种包含根据权利要求1所述的酶或根据权利要求13所述的核酸的组合物，其用于 受试者中肿瘤细胞的治疗。30. 如权利要求29所述的组合物，其中所述酶偶联到聚乙二醇(PEG)。31. 如权利要求29所述的组合物，其中所述酶酸针对细菌、真菌、昆虫或哺乳动物中的 表达进行密码子优化。32. 如权利要求29所述的组合物，其中所述组合物经配制用于肿瘤内、静脉内、皮内、动 脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、眼内、鼻内、玻璃体内、阴道 内、直肠内、肌肉内、皮下、结膜下、囊内、粘膜、心包内、脐带内、经□施用。33. 如权利要求29所述的组合物，其中所述组合物经配制用于施用于所述肿瘤细胞的 营养培养基中。34. 如权利要求33所述的组合物，其中所述营养培养基为血液、淋巴液或脊髓液。35. 如权利要求29所述的组合物，其进一步包含至少一种第二抗癌疗法。36. 如权利要求35所述的组合物，其中所述第二抗癌疗法为化学疗法、激素疗法、免疫 疗法或细胞因子疗法。37. 根据权利要求1所述的酶或根据权利要求13所述的核酸的用途，其用于制造用于治 疗肿瘤细胞的药剂。
【专利摘要】本发明描述涉及具有甲硫氨酸-γ-裂解酶活性的改进蛋白的工程改造的方法和组合物。例如，在某些方面，可公开一种包含一种或多种氨基酸取代并且能够降解甲硫氨酸的经修饰胱硫醚-γ-裂解酶(CGL)。此外，本发明的某些方面提供使用所公开的蛋白或核酸来治疗具有甲硫氨酸缺乏的癌症的组合物和方法。
【IPC分类】C12N15/60
【公开号】CN105531371
【申请号】CN201480050681
【发明人】G·乔治欧, E·斯通, W-C·卢
【申请人】得克萨斯大学体系董事会
【公开日】2016年4月27日
【申请日】2014年8月29日
【公告号】CA2922550A1, EP3039139A2, US20150064159, WO2015031726A2, WO2015031726A3