/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
[0186] 本发明实施方案的任何化合物或疗法向患者的施用将遵循关于所述化合物的施 用的一般方案，虑及所述试剂的毒性(如果有的话）。因此，在一些实施方案中，存在监测可 归因于组合疗法的毒性的步骤。
[0187] A.化学疗法
[0188] 多种化学治疗剂可根据本发明实施方案使用。术语"化学疗法"是指使用药物来治 疗癌症。"化学治疗剂"用于意指在癌症的治疗中施用的化合物或组合物。运些试剂或药物 通过其在细胞内的活性模式来分类，例如其是否和在哪个阶段影响细胞周期。或者，试剂可 基于其直接交联DNA、插入DNA中或通过影响核酸合成来诱导染色体和有丝分裂崎变的能力 来表征。
[0189] 化学治疗剂的实例包括烷基化剂，如嚷替派和环憐酷胺;烷基横酸醋，如白消安、 英丙舒凡和赃泊舒凡;氮丙晚，如苯佐替赃、卡波酿、美妥替赃和乌瑞替派;乙撑亚胺和甲基 蜜胺，包括六甲蜜胺、Ξ亚乙基蜜胺、Ξ亚乙基憐酷胺、Ξ亚乙基硫代憐酷胺和Ξ径甲蜜胺 (trimethylolomelamine );多聚乙酷（特别是布拉他辛（bul latacin)和布拉他辛酬 (bullatacinone));喜树碱(包括合成类似物拓扑替康）；草苔虫素；海绵多締酬类化合物 (callystatin) ;CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物）；隐藻素 (cryptophycinK特别是隐藻素1和隐藻素8);多拉司他汀；多达霉素（包括合成性类似物 KW-2189和CB1-TM1);艾恼塞洛素;水鬼蕉碱;甸枝珊瑚醇;海绵素;氮芥类，如苯下酸氮芥、 糞氮芥、氯憐酷胺、雌莫司汀、异环憐酷胺、氮芥、盐酸氧氮芥、美法仓、新氮芥、苯芥胆酱醇、 泼尼莫司汀、曲憐胺和尿喀晚氮芥;亚硝基脈类，如卡莫司汀、氯脈菌素、福莫司汀、罗莫司 汀、尼莫司汀和雷莫司汀;抗生素，如締二烘抗生素(例如卡奇霉素，尤其卡奇霉素 λ??和卡 奇霉素 Ω II);达内霉素，包括达内霉素 Α;双麟酸盐，如氯麟酸盐;埃斯波霉素；W及新制癌 菌素发色团和相关的色蛋白締二烘抗生素发色团、阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素 (authrarnycin)、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素 C、卡柔比星（carabicin)、去甲柔红霉 素、嗜癌霉素、色霉素（chromomycinis)、放线菌素 D、多柔比星、地托比星、6-重氮基-5-氧 代正白氨酸、亚德利亚霉素(包括吗嘟基-亚德利亚霉素、氯基吗嘟基-亚德利亚霉素、2-化咯嘟基-亚德利亚霉素和脱氧亚德利亚霉素）、表柔比星、依索比星、伊达比星、马塞罗霉 素、丝裂霉素（如丝裂霉素 C )、霉酪酸、诺加霉素、橄揽霉素、培洛霉素、泊非霉素 (potfiromycin)、嚷岭霉素、Ξ铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美 司、净司他汀和佐柔比星;抗代谢物，如甲氨蝶岭和5-氣尿喀晚(5-FU);叶酸类似物，如二甲 叶酸、蝶罗岭和曲美沙特;嚷岭类似物，如氣达拉滨、6-琉基嚷岭、硫咪嚷岭和硫鸟嚷岭;喀 晚类似物，如安西他滨、阿扎胞巧、6-氮尿巧、卡莫氣、阿糖胞巧、双脱氧尿巧、去氧氣尿巧、 依诺他滨和氣尿巧;雄激素，如卡鲁睾酬、丙酸屈他雄酬、环硫雄醇、美雄烧和睾内醋;抗肾 上腺药，如米托坦和曲洛司坦;叶酸补充剂，如亚叶酸;醋葡醒内醋;醒憐酷胺糖巧;氨基乙 酷丙酸;嗯尿喀晚;安叮晚;百垂布昔；比生群;依达曲沙;地憐酷胺;秋水仙胺;地叮酿;依氣 鸟氨酸；依利醋锭;埃坡霉素；依托格鲁;硝酸嫁;径脈;香茹多糖;氯尼达明；美登素类化合 物，如美登素和安斯菌素;米托脈腺;米托蔥酿;莫赃达醇;尼曲叮晚(nitraerine);喷司他 下；蛋氨氮芥(地enamet);化柔比星;洛索蔥酿;鬼白酸；2-乙基阱;丙卡己阱;PSK多糖复合 物;丙亚胺;利索新；西佐喃;错螺胺;细交链抱菌酬酸己亚胺酿;2，2/，2"-立氯立乙胺;单 端抱霉締(尤其T-2毒素、痛抱菌素 A、杆抱菌素 A和蛇形菌素）；乌拉坦;长春地辛;达卡己嗦； 甘露莫司汀;二漠甘露醇;二漠卫矛醇;赃泊漠烧;糖胞喀晚(gac^osine);阿糖胞巧（"Ara-C'）；环憐酷胺;紫杉烧类化合物，例如紫杉醇和多締紫杉醇;吉西他滨;6-硫鸟嚷岭;琉基嚷 岭;销配位络合物，如顺销、奥克赛销和卡销;长春碱;销;依托泊巧(VP-16);异环憐酷胺;米 托蔥酿;长春新碱;长春瑞滨;诺安托;替尼泊巧;依达曲沙;道诺霉素;氨基蝶岭;希罗达;伊 班麟酸盐;伊立替康(例如CPT-11);拓扑异构酶抑制剂RFS 2000;二氣甲基鸟氨酸(DMF0); 类视色素，如视黄酸;卡培他滨;卡波销、丙卡己阱、寡霉素、吉西他滨、新霉酷胺、法呢基-蛋 白转移酶抑制剂、反式销和W上任一者的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
[0190] B.放射疗法
[0191] 引起DM破坏并且已经广泛使用的其他因素包括通常称作丫射线、X射线者，和/或 放射性同位素向肿瘤细胞的定向递送。还涵盖其他形式的DNA破坏因素，如微波、质子束照 射(美国专利5,760,395和4,870,287)和UV照射。最有可能所有运些因素均影响对DNA、DNA 的前体、DNA的复制和修复和染色体的组装和维持的广泛范围的破坏。针对X射线的剂量范 围介于在延长时间段(3至4周）内50至200伦琴的每日剂量至2000-6000伦琴的单一剂量范 围内。针对放射性同位素的剂量范围广泛变化，并且取决于所述同位素的半衰期、所发射的 放射的强度和类型W及寶生性细胞的摄取。
[0192] C.免疫疗法
[0193] 熟练技术人员应了解，免疫疗法可与所述实施方案的方法组合或联合使用。在癌 症治疗的上下文中，免疫治疗剂一般依赖于免疫效应细胞和分子的使用W祀向和破坏癌细 胞。利妥昔单抗(RITUXAN@)为所述实例。所述免疫效应子可为例如对肿瘤细胞的表面 上的一些标志物具特异性的抗体。所述抗体单独可用作疗法的效应子或其可募集其他细胞 来实际影响细胞杀死。所述抗体还可缀合于药物或毒素(化学治疗剂、放射性核素、篇麻毒 素 A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)并且仅用作祀向剂。或者，所述效应子可为携带直接或间 接地与肿瘤细胞祀相互作用的表面分子的淋己细胞。各种效应细胞包括细胞毒性T细胞和 NK细胞。
[0194] 在免疫疗法的一方面，肿瘤细胞必须具有一些服从祀向（即不存在于大多数的其 他细胞上）的标志物。存在多种肿瘤标志物并且运些标志物中的任一者均可适用于本发明 实施方案的上下文中的祀向。常见肿瘤标志物包括CD20、癌胚抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、 TAG-72、HMFG、液酸化路易斯抗原、MucA、MucB、PLAP、层粘连蛋白受体、erb B和P155。免疫疗 法的一个替代方面是组合抗癌效应与免疫刺激效应。免疫刺激分子也存在，包括:细胞因 子，如化-2、比-4、比-12、GM-CSF、丫 -IFN;趋化因子，如MIP-1、MCP-1、化-8;和生长因子，如 化T3配体。
[01%]目前在研究中或在使用中的免疫疗法的实例为免疫佐剂，例如牛分枝杆菌、恶性 追原虫、二硝基氯苯和芳族化合物（美国专利5,801，005和5,739，169;化巧日化3山111〇1〇， 1998;化ristodoulides等人，1998);细胞因子疗法，例如干扰素 α、β和丫、化-1、GM-CSF和 TNF(Bukowski 等人，1998;0日￥1(13〇11等人，1998;化1131^11(1等人，1998);基因疗法，例如 了册、化-1、比-2和口53(9111等人，1998;41131111-胖日'(1和￥111日36。日，1998;美国专利5,830,880 和5,846,945);和单克隆抗体，例如抗〔020、抗神经节巧脂612和抗9185化〇11311(16'，2012; 化nibuchi等人，1998;美国专利5,824,311)。预期一种或多种抗癌疗法可与本文所述的抗 体疗法一起使用。
[0196] D.手术
[0197] 约60%的患有癌症的人将经历一些类型的手术，其包括预防性、诊断性或分期、治 愈性和姑息性手术。治愈性手术包括其中所有或一部分癌性组织W物理方式去除、切除和/ 或破坏的切除术，并且可与其他疗法，如本发明实施方案的治疗、化学疗法、放射疗法、激素 疗法、基因疗法、免疫疗法和/或替代疗法联合使用。肿瘤切除术是指肿瘤的至少一部分的 物理去除。除肿瘤切除术W外，通过手术进行的治疗还包括激光手术、冷冻手术、电外科手 术和用显微镜控制的手术(莫氏手术）。
[0198] 在切除癌性细胞、组织或肿瘤的一部分或全部后，可在身体中形成空腔。治疗可通 过灌注、直接注射或具有额外抗癌疗法的区域的局部应用来实现。所述治疗可重复，例如每 隔1、2、3、4、5、6或7天，或每隔1、2、3、4和5周或每隔1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。运 些治疗也可具有变化的剂量。
[0199] E.其他试剂
[0200] 预期其他试剂可与本发明实施方案的某些方面组合使用W改进治疗的治疗功效。 运些额外试剂包括影响细胞表面受体和GAP结的上调的试剂、细胞抑制和分化试剂、细胞粘 着抑制剂、增加过度增生细胞对细胞调亡诱导剂的敏感性的试剂或其他生物试剂。通过提 高GAP结的数目实现的细胞间信号传导的增加将增加对相邻过度增生细胞群体的抗过度增 生效应。在其他实施方案中，细胞抑制或分化试剂可与本发明实施方案的某些方面组合使 用W改进治疗的抗过度增生功效。预期细胞粘着抑制剂改进本发明实施方案的功效。细胞 粘着抑制剂的实例为粘着斑激酶(FAK)抑制剂和洛伐他汀。进一步预期增加过度增生细胞 对细胞调亡的敏感性的其他试剂(如抗体C225)可能与本发明实施方案的某些方面组合使 用W改进治疗功效。
[0201] XII.试剂盒
[0202] 本发明的某些方面可提供试剂盒，如治疗试剂盒。例如，试剂盒可包含一种或多种 如本文所述的药物组合物和任选地关于其使用的说明书。试剂盒还可包含一种或多种用于 实现所述组合物的施用的器件。例如，本发明试剂盒可包含药物组合物和用于实现所述组 合物向癌性肿瘤中的直接静脉内注射的导管。在其他实施方案中，本发明试剂盒可包含任 选地配制为医药品或冻干的工程改造的甲硫氨酸酶的预填充安飯，与递送器件一起使用。
[0203] 试剂盒可包含具有标签的容器。适合的容器包括例如瓶、小瓶和试管。所述容器可 由多种材料，如玻璃或塑料形成。所述容器可容纳包括有效用于治疗或非治疗应用的工程 改造的甲硫氨酸酶的组合物，如上文所述。所述容器上的标签可指示所述组合物用于特定 疗法或非治疗应用，并且还可指示关于体内或体外使用的指导，如上文所述的那些。本发明 的试剂盒将典型地包含上文所述的容器和一个或多个包含由商业和使用者观点来说可需 要的材料的其他容器，所述材料包括缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射器和具有使用说明书 的包装插页。
[0204] XIII.实施例
[0205] 包括W下实施例W证明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应了解，W下实 施例中所公开的技术表示由本发明人发现在本发明的实践中运作良好的技术，并且因此可 被视为构成优选的其实践模式。然而，本领域技术人员根据本发明应了解，在所公开的特定 实施方案中可进行多种改变并且所述改变仍获得类似或相似的结果而不偏离本发明的精 神和范围。
[0206] 实施例1-针对甲硫氨酸-γ -裂解酶活性工程改造的脫硫酸-γ -裂解酶
[0207] C化为催化哺乳动物转硫途径中的最后步骤的四聚体(Rao等人，1990) dC化催化k 脫硫酸转化为k半脫氨酸、α-酬基下酸醋和氨。人类C化化CGDcDNA先前已经克隆并且表 达，但具有相对低产率(约5mg/L培养物）（Lu等人，1992; Steegborn等人，1999)。使用OiL和 MGL酶的序列和结构比对作为指导，将hC化转化为用于甲硫氨酸的有效降解的酶。
[0208] 实施例2-改进的经修饰人类脫硫酸-丫 -裂解酶的基因合成和表达
[0209] 人类脫硫酸-丫-裂解酶基因含有大肠杆菌中很少使用并且可干扰表达的多种密 码子。因此，为了优化大肠杆菌中的蛋白表达，各别基因用使用DNA-Works软件化oover等 人，2002)设计的密码子优化的寡核巧酸组装。各构建体含有N端Ncol限制位点、框内N端 化S6标签和用于简化克隆的C端EcoRI位点。在克隆至祀T28a载体(Novagen)中之后，含有适 当脫硫酸酶表达载体的大肠杆菌(BL21)在37°C下在25化pm下的振荡烧瓶中使用含50yg/mL 卡那霉素的极品肉汤（TB)培养基生长，直至实现约0.5-0.6的OD600。此时，所述培养物转到 在25°C下的振荡器中，用0.5mM IPTG诱导，并且允许表达蛋白再持续12h。细胞集结粒接着 通过离屯、收集并且再悬浮于IMAC缓冲液（lOmM化P〇4/10mM咪挫/300mM化Cl，pH 8)中。在 通过弗氏细胞压碎器溶解之后，溶解产物在4°C下在20，OOOx g下离屯、20min，并且所得上清 液应用于儀IMAC柱，用10-20个柱体积的IMAC缓冲液洗涂，并且接着用IMAC洗脱缓冲液 (50mM化P〇4/250mM咪挫/300mM化Cl，pH 8)洗脱。含有酶的部分接着在25°C下用lOmM化唉 醒-5/ -憐酸(PLP)解育1小时。使用10,000MWC0离屯、过滤器件（AMICON⑥)，蛋白接着数次 缓冲液交换至lOOmM PBS、10 %甘油、pH 7.3溶液中。酶等分试样接着在液氮中急骤冷冻并 且存储于-80°C下。W运种方式纯化的OiL和OiL变体为>95 %均质，如通过SDS-PAGE和考马 斯染色所分析。产率基于6M盐酸脈、20mM憐酸盐缓冲液(pH 6.5)的最终缓冲液浓度中的计 算消光系数λ28() = 29,870Μ-νπι-ι计算为约400mg/L培养物(Gill和von Hippel，1989)。
[0210] 实施例3-针对甲硫氨酸-丫 -裂解酶活性和排序克隆的96孔板筛选
[0211] Μ化和C化从其各自底物产生2-酬基下酸。使用3-甲基苯并嚷挫嘟-2-酬腺(MBTH) 来检测α-酬酸的比色测定(Takakura等人，2004)针对96孔板格式定比例W用于筛选小的文 库并且用于对具有最大MET酶（甲硫氨酸-γ-裂解酶)活性的克隆排序。运种板筛选提供一 种用于从诱变文库炼选最具活性克隆的容易方法。选择展示大于亲本对照的活性的克隆用 于进一步表征，因此消除了纯化用于动力学分析的不少变体的需要。
[0212] 将含有诱变的hCGL、hC化或ρΜ化的单一群落炼选至每孔含有75化含有50yg/mL卡 那霉素的TB培养基的96孔培养板中。运些培养物接着在37°C下在板振荡器上生长，直至实 现约0.8-1的ODsqq。在冷却至25°C之后，添加每孔额外75化含有5化g/mL卡那霉素和0.5mM IPTG的培养基。在25°C下在振荡下执行表达持续化，之后将每孔10化L培养物转移至96孔分 析板中。所述分析板接着离屯、W使细胞集结成粒，去除培养基并且通过添加每孔50化 B-PE民渡蛋白萃取试剂(Pierce)使细胞溶解。在通过离屯、清除后，溶解产物用5mM L-Met 在37°C下解育10-1化。接着通过添加3份0.03%MBTH溶液/IM乙酸钢(pH 5)使所述反应衍 生。所述板在50°C下加热40min并且在冷却后在320nm下在微量滴定板读取器中读数。
[0213] 实施例4-用于产生源于hCGL-E59N-R119kE339V的改进的甲硫氨酸降解变体的文 库设计
[0214] 用于hCGL-E59N-R119L-E339V化CGL-NLV)甲硫氨酸降解酶的基因用作起点来产生 具有活性改进的其他变体。使用来自各种生物体的MGL和C化序列产生氨基酸序列比对。在 其中所述M(iL酶均具有一个保守残基并且所述OiL酶均具有不同的保守残基的特异性比对 位点处鉴定针对诱变选择的区域。尽管M(iL和OiL具有高度同源结构，但其不会降解彼此的 各自底物，因此在Μ化和C化酶之间系统发育上保守的氨基酸序列的差异可指示对于降解其 各自底物重要的残基。通过重叠延伸PCR使用含有用于编码保守残基的亲本hCGk^V模板 的密码子或用于对应的Μ化保守残基的密码子的寡核巧酸产生文库。最终组装的PCR产物用 化〇1和EcoRI消化并且用T4DNA连接酶接合至祀T28a载体中。所得接合直接转化至大肠杆菌 (BL21)中并且接种于LB-卡那霉素板上用于如实施例3中所述进行后续筛选。筛选比所述文 库的理论多样性多两倍的群落（即，由所述文库编码的所有可能的基因序列）。分离展示大 于亲本hCGL-NLV变体的活性的克隆并且定序W鉴定赋予改进的活性的突变。具有改进的k 甲硫氨酸降解活性的克隆在所述的反复数轮诱变中用作模板。
[0215] 实施例5-改进的人类甲硫氨酸降解变体的表征
[0216] 在数轮如实施例巧日4中所述的诱变和筛选后，发现除最初Ξ个突变位点（即E59N-R11化-E339V)外还有五个氨基酸位置赋予相比于hCGL-NLV改进的甲硫氨酸降解活性。运些 额外位置位于hC化(SE Q ID N0:1)残基63、91、268、311和353处(参见图1)。运些位置中的 一者或多者突变为56化、1^9謹、1(2681?、了3116和13535与在位置59、119和339处的残基突变组 合可导致与hCGkNLV相比改进的针对降解k甲硫氨酸的kcat/KM值。具体说来，所述含有对 应于SEQIDN0:3，hCGレE59N-S63レL91M-Rll化-K268R-T311G-E339V-I353S化CGレ8mut- 1) ;沈Q ID N0:4，hC化-E59I-S63kL91M-Rll化-K268R-T311G-E339V-I353S化C化-8mut- 2) ;WQIDN0:5，h(XL-E59N-S63L-L91M-R119A-K268R-T311G-E339V-I353S(h(XL-8mut- 3) ;和沈Q ID N0:6，hCGレE59I-S6：3L-L91M-R119A-K268R-T311G-E339V-I353S化CGレ8mut- 4) 的氨基酸取代的变体显示具有最高的针对降解レ甲硫氨酸的k。at/KM值。运些变体化CGレ 8mut-(l-4))如实施例2中所述纯化至如通过SDS-PAGE所分析大于95%均质性并且使用类 似于实施例3中所述的测定的ImL规模MBTH测定W动力学方式表征其在1 OOmM PBS缓冲液中 在抑7.3和37°C下降解kMet的能力。
[0217] 表1.使用hCGUhCGkNLV和改进的变体hCGk8mut(l-4)在抑7.3和37°C下实现的 心甲硫氨酸降解的米-曼二氏动力学的比较。
[021 引
[0219] ND =未确定
[0220] 实施例6-hCGk8mut-l针对肿瘤细胞系的细胞毒性
[0221] 针对黑素瘤细胞系A375和前列腺癌细胞系DU145和PC3分析hCGL-8mut-l的体外细 胞毒性。细胞W约3000个细胞/孔接种于96孔培养板中针对所述A375细胞的DMEM培养基或 针对所述前列腺肿瘤细胞系的RPMI-1640培养基中并且允许生长2地，接着用变化浓度的酶 进行处理。在处理5天后，使用（3-(4,5-二甲基嚷挫-2-基)-5-(3-簇基甲氧基苯基)-2-(4-横苯基)-2H-四氮挫(MTS)测定来测量增生。针对A375所得的数据的分析产生0.0祉Μ的表观 IC50值，并且针对DU145产生0.21μΜ的表观IC5Q值，并且针对PC3前列腺肿瘤细胞产生0.25μΜ 的表观ICso值(图2)。
[0222] 实施例7-hCGk8mut-l的药理学制剂
[0223] 所述hC化-8mut-l酶如实施例2中所述进行纯化，具有一个例外：在结合于所述 IMAC柱之后，所述蛋白用含有ο. 1 % TRITON? 114的IMAC缓冲液广泛地洗涂(90-100个柱 体积）。接着，所述柱用10-20个柱体积的IMAC缓冲液洗涂并且用IMAC洗脱缓冲液（50mM 化P〇4/250mM咪挫/300mM化Cl，pH 8)洗脱。用TRITON饭114洗涂用于内毒素去除。所述 纯化蛋白使用10，OOCMWCO过滤器件(Am