一种癌症筛检的方法
【专利说明】-种癌症筛检的方法
[0001 ] 本申请是申请日为2008年04月29日，中国专利申请第200810094659.2号的分案申 请。
技术领域
[0002] 本发明设及一种癌症筛检的方法，特别设及一种W甲基化DNA作为生物标记的癌 症筛检的方法，属于医学分子生物学领域。
【背景技术】
[0003] 子宫颈癌是全球及台湾女性主要的死因之一，根据2002年世界卫生组织(W册）的 统计，子宫颈癌为全球女性癌症死因的第二位，仅次于乳癌;定期接受子宫颈癌筛检是预防 子宫颈癌的最佳方法，常用子宫颈癌筛检的方式主要有两种，一是最常见的子宫颈抹片检 查(Pap smear),另一则为人类乳突病毒检验化PV testing);子宫颈抹片检查是取出子宫 颈部之分泌物，W显微镜观察其中脱落之上皮细胞中，是否有癌病变产生，W早期侦测子宫 颈癌；而册V检验则是W反转录聚合酶连锁反应（reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)检查样本中是否存在有人类乳突病毒化uman papilloma virus, HPV)病毒基因的表现。
[0004] 然而，由于子宫颈抹片检查(Pap smear)需要靠医师取样、检验师/病理医师判读 抹片，除了容易产生高伪阴性率化igh false negative rate)而延迟癌前病变的诊断与治 疗之外，再者，所需的人力成本太高，运对许多发展中的国家来说，有推广上的困难;另一方 面，人类乳突病毒检验化PV testing)虽具有高敏感度，却容易造成高伪阳性率（High false positive rate)，不仅让病患白白担屯、，也会浪费许多医疗资源在伪阳性患者的追 踪检查上；因此，如何提高子宫颈癌检验方法的准确性及方便性，是推广子宫颈癌检验的重 要课题之一。
[0005] 在子宫颈癌的病原学上，感染致癌的人类乳突病毒化PV)是最显着的危险因子； zur化usen于2002年的报告显示，"高危险"人类乳突病毒化PV)产生的E6/E7致癌蛋白 (oncoprotein)会与肿瘤抑制基因 p53/pRB作用，造成细胞周期调节异常;事实上，人类乳突 病毒化PV)的DNA可在所有的子宫颈癌病例中被侦测到。然而，感染人类乳突病毒化PV)虽为 产生子宫颈癌必要的条件，但却不足W导致子宫颈癌的发生;大约有60%低度鱗状细胞上 皮内病变（low-grade squamous intraepithelial lesions,LSIL)会复原（re邑ress) ,30% 则会持续（persist) ,5-10%会发展为高度鱗状细胞上皮内病变化igh-grade squamous inhaepithelial lesions,HSIL)，只有少于1%会变成子宫颈癌。HPV的持续感染W及病毒 量(viral load)可能是发展成为高度鱗状细胞上皮内病变化SIL)及癌症的决定因子;然 而，子宫颈癌发生的分子机制仍有待确认。
[0006] 其它的因子，如:环境及基因的改变，可能也在子宫颈角质细胞的恶化上扮演重要 的角色;且不论是否由HPV所激活，基因的改变造成基因组的不稳定已长久被认为是子宫颈 癌发生的重要机制，由细胞发生学上的研究显示，在子宫颈癌细胞内存在有非随机染色体 的改变(non-random chromosomal changes);另外，数个分子遗传学的研究则鉴识出一些 时常发生去异质化（loss of heterozygosity,L0H)的位置，运些位置可能跟子宫颈癌发生 时的肿瘤抑制基因 （t皿or SU卵ressor genes,TSGs)有关联。
[0007]基因的缺失(genomic deletions)被认为是肿瘤形成的重要因素，长久W来，我们 都习惯了基因组中的编码是仰赖ATCG四个碱基排列的观念，Knudson早在1975年即提出双 重受创理论(two-hit theo巧），指出一些同源肿瘤抑制基因伴随的突变或缺失可能造成或 易造成癌症的发生;然而，其它影响表现型(pheno typ e)的讯息可能存于被修饰过的碱基5- 甲基胞喀晚巧-methylc^osine)中，5-甲基胞喀晚被发现存在于哺乳类动物细胞内的回文 序列5 ' -CpG-3 '中，在哺乳类动物细胞内除了一些被称为乂pG岛"（CpG islands，CGIS)的区 域之外，大多数的CpG双核巧酸对都被甲基化，CpG岛是指在大约1000个碱基对(1肺)的区域 内含有大量的GC-W及CpG-，通常位于基因的附近，且在广泛表现的基因之激活子附近被发 现。胞喀晚的甲基化发生在DM合成后，自一甲基捐赠者S-腺核巧甲硫胺酸（S- adenosylmethionine，SAM)将一甲基经酵素转移到胞喀晚第5个碳的位置上，该酵素反应系 由DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DNMTs)执行，DNMTl是哺乳类动物主要的甲基 转移酶，系负责将半甲基化位置复制后修复(post-r邱licative restoration)为全甲基 化，被称为维持甲基化(maintenance methylation);反之，DNMT3A及DNMT3B则被认为主要 负责甲基化新的位置，进行一种称为重新甲基化(de novo methylation)的步骤。
[000引 CpG双核巧酸对甲基化的遗失（loss of methylation),意即一般的低度甲基化， 是癌细胞内的第一个超遗传异常（邱igenetic abnormality);然而，在过去几年内的研究 却显示，特定位置（例如：一些肿瘤抑制基因）的高度甲基化（S i t e - S P e C i f i C hypermethy lation )与其功能的丧失有关，运可能会在癌症生成时提供选择优势 (selective advantages);在激活子区域上CpG岛的高度甲基化，可W藉由组蛋白修饰 化istone modification)伴随接续而来的基因默化现象(gene silencing)，来引起染色质 改造 (chromatin remodeling);除了染色体缺失及基因突变之外，经由激活子的高度甲基 化所造成肿瘤抑制基因的超遗传默化现象(epigenetic silencing)也常见于人类癌症中。
[0009] 最近的流行病学研究显示，血清葉酸盐（serum folate)的浓度（一种甲基的主要 来源）与HPV的感染和清除有关联;在甲基周期(methyl cycle)的代谢作用中，酵素的基因 多型性(genetic polymo巧hisms)也曾被报导与子宫颈上皮内病变的发展有关;如同超基 因演化的观念一般，DNA甲基化与子宫颈癌间关联的研究也同样盛行，子宫颈癌的DNA甲基 化研究日与遽增，显示使用甲基化作为子宫颈癌筛检的可能性；由于遗传与环境交互作用 的特性，肿瘤抑制基因甲基化程度因不同的基因及不同的族群而异，不同的疾病也会有不 同的甲基化表现型(methylator phenotypes);然而，子宫颈癌的甲基化表现型W及其与 HPV基因型的关联仍未知，而子宫颈癌中有何特定的基因会被甲基化，W及需要多少基因方 可达到临床应用的需求，运些问题仍是未来需要被确认的议题。
[0010] 由此可见，上述常用子宫颈癌筛检方法仍有诸多缺失，亟待加 W改良。
[0011] 本发明人鉴于上述常用子宫颈癌筛检方法所衍生的各项缺点，、加 W改良创新，并 经多年苦屯、孤诣潜屯、研究后，终于成功研发完成本发明癌症筛检的方法。圆(wafer)的叠层 (S化eking)技术有望成为下一代高端化igh end)半导体的核屯、技术。因此，各领域正在活 跃地展开关于晶圆叠层的研发。
【发明内容】
[0012] 本发明之目的即在于提供一种子宫颈癌筛检的方法，W作为第一线子宫颈癌的筛 检（C曰ncer screen)〇
[0013] 本发明之次一目的是在于提供一种子宫颈癌筛检的方法，该方法除了可作为第一 线子宫颈癌的筛检之外，亦可作为第二线子宫颈癌的筛检，辅助人类乳突病毒检验化PV testing)，W达到更准确之子宫颈癌筛检效果。
[0014] 本发明之另一目的系在于提供一种癌症诊断的方法，该方法除可应用在子宫颈癌 的检测上，亦可应用于其它癌症(如:卵巢癌、肝癌）的检测，W辅助异常检体之诊断。
[0015] 可达成上述发明目的之一种癌症筛检的方法，系检测受测检体细胞中目标基因甲 基化的状态，W作为癌症有无的筛检指针，该方法包含下列步骤：
[0016]步骤1提供一雙测检体；
[0017] 步骤2检测该受测检体之基因组DNA中至少一个目标基因的CpG序列甲基化状态， 该目标基因是由50乂1、口4乂1、11?^、歷乂6-1、胖1'1^及0肥抓1'1所组成；^及
[0018] 步骤討良据该目标基因甲基化状态的有无，判断该检体是否具有癌症或癌前病变。
[0019] 其中该受测检体为子宫颈抹片、腹水、血液、尿液、粪便、疲、口腔粘膜细胞、胃液、 胆汁、子宫颈上皮细胞等。
[0020] 其中该目标基因的CpG序列甲基化状态检测方法为甲基化特异性聚合酶连锁反应 (methylation-specif ic PCR,MSP)、定量甲基化特异性聚合酶连锁反应（quantitative methylation-specific PCR,QMSP)、亚硫酸盐定序（bisulfite sequencing,BS)、微数组 (microarrays)、质谱仪分析(mass speedometer)、变性高效液相色谱（denaturing hi曲- perform曰nee liquid chrom曰togr曰phy,DHPLC)〇
[0021 ]其中该目标基因 SOXl是具有如SEQ I