包含一系列完整的卵巢肿瘤样本， 包括卵巢良性肿瘤样本(n = 36)、卵巢边缘性肿瘤样本（n = 6)、卵巢恶性肿瘤样本(n = 122);所有的子宫颈样本及卵巢样本均取自台北Ξ军总医院的妇科肿瘤组织库，各样本的 基因组DNAWQiagene DNA套组抽取，并WPicoGreen蛋光吸收法定量DNA，且W凝胶电泳检 巧化NA的品质。
[0071] 另外，肝细胞样本则包含正常肝细胞样本（n= 13)、慢性肝炎（n= 15)、肝硬化 (cirrhosis ,n = 40)、肝癌化epatocellular ca;rcinoma,HCC,n = 54);所有的肝细胞样本均 取自台北Ξ军总医院一般外科肿瘤组织库，各肝细胞样本的基因组DNA也是WQiagene DNA 套组抽取，并WPicoGreen蛋光吸收法定量DM，且W凝胶电泳检测DM的品质。
[0072] 二、使用CpG岛微数组（CpG island microarrays)进行差异甲基化杂合反应 (Differential Methylation Hybridization,DMH)
[0073] 取30个子宫颈癌组织样本的DM混合在一起，另外取10个正常子宫颈抹片样本的 DNA混合在一起，样本的DNAW限制酶Msel酶切后，粘接（ligated)到连接子（linkers)上，随 后W对甲基化敏感之限制酶(methylation-sensitive restriction enzymes)HpaIlW及 BstUI进行酶切，再将该DM作为PCR的模版(template)进行20个循环(cycles)的扩增，并W 蛋光染剂标记，正常子宫颈抹片样本的DM W蛋光染剂切3标记，子宫颈癌组织样本的DNA则 W蛋光染剂切5标记；将标记好的样本DNA作为探针，与含有8,640CpG岛卷标(CpG island tags)的CpG岛微数组（CpG island microarrays)进行杂交反应，WCGI数据库（网址： ht1:p V/derlab.med.utoronto. ca/CpGIslands/)来辨识被挑选到的CpG岛。微数组数据W GenePix 6.0软件的圆形特征模式（circular-features mode)分析，标记重复挑选的选殖 株(C1 one )，W及过滤去除掉不被接受的特征；切5对切3的比率(ratio)大于2.0的基因位 (loci)为在混合的子宫颈癌组织样本中具有高度甲基化的基因，因此接受比率大于2.0的 基因位。
[0074] Ξ、亚硫酸盐修饰作用（Bisulfite modification)、甲基化特异性聚合酶连锁反 应(methylation-specific PCR,MSP)W及亚硫酸盐定序(bisulfite sequencing，BS)
[007引使用化emicon公司出产之DNA修饰套组（DNA modif ication kit, Chemicon , Ternecula,CA)进行亚硫酸盐修饰作用：取化g样本的基因组DNA(genomic DNA)，W亚硫酸 钢对基因组DM进行化学修饰，在单链DM中，所有非甲基化的胞喀晚都会发生脱氨基作用 而转变成尿喀晚，而甲基化的胞喀晚则不被修饰，仍保持5-甲基胞喀晚的状态；最后，将反 应后的样本DNA溶于70μ1 55°C的TE缓冲液(TE buffer)中，W进行甲基化特异性PCR(MSP)。
[0076] 另取人类周围血(peripheral blood)的正常DNA进行亚硫酸盐修饰作用，W作为 具有非甲基化激活子序列的对照组；并将人类的正常DNAWSssI甲基转移酶 (me1:hyltransferase,化W lingland Biolabs,Beve;rly ,ΜΑ)处理，W得到具有甲基化对偶基 因的阳性对照组。
[0077] 取lyg经过亚硫酸盐修饰作用后的样本基因组DNA，W及对照组和阳性对照组DNA， WMS巧斤进行甲基化特异性PCR扩增，该MS巧斤分为两种，一种为可专一辨认非甲基化基 因序列的MSP引子化），另一种为可专一辨认甲基化基因序列的MSP引子(M)，各目标基因的 MSP引子序列如表一所示；甲基化特异性PCR反应物的总体积为25μ1，包含化1已修饰过的模 版DNA、每一引子各 1.5pmol、0.2mmol/L dNTPsW及limit Gold Taq DNA polymerase (Applied Biosystems,Foster City,CA);将混合好的反应物置于95°C下5分钟，接着W95 °C解离(denature) 30秒、适当引子粘合(anneal ing)溫度粘合30秒、72 °C合成30秒为循环， 解离、粘合、合成步骤共重复35个循环，之后再置于72Γ反应5分钟。扩增后的产物W含有漠 化乙锭(61:111山111]1131'〇1]11(16,6181')的2.5%琼脂胶体进行电泳分析，并置于紫外光下照射观 察。
[007引表一甲基化特异性PCR(MSP)所使用之MSP引子的序列 [0079]
[0080]
[008。 弓斤种类Μ代表可专一辨认甲基化基因序列的MSP引子。
[0082] 弓斤种类U代表可专一辨认非甲基化基因序列的MSP引子。
[0083] 所有的样本均进行至少两次独立的亚硫酸盐修饰作用及甲基化特异性PCR，在使 用可专一辨认甲基化基因序列的MSP引子(M)所进行的PCR反应中，若同一样本无法合成出 PCR产物两次W上，则视为该样本不具甲基化;将使用可专一辨认甲基化基因序列的MSP引 子(M)所扩增之PCR产物选殖到PCR4-T0K)载体（Invitrogen，Carlsbad，CA)中，选取至少5个 独立的选殖株(clones)进行亚硫酸盐定序(BS)，亚硫酸盐定序(BS)所使用的引子如表二所 示，使用377自动定序仪(Applied Biosystems,i^ster City,CA)进行亚硫酸盐定序。
[0084] 表二亚硫酸盐定序(BS)所使用之引子的序列
[0085]
[0086] 四、经由5'-杂氮-2'-脱氧胞巧（5'-aza-2'-deo巧巧tidine)处理，使甲基化基因 在子宫颈癌细胞株内再表现
[0087] 首先在化La子宫颈癌细胞株中，W甲基化特异性PCR(MSP)测试可能具有高度甲基 化的基因之甲基化状态，并选出具有甲基化的基因。再将化La子宫颈癌细胞株Κ?ΟμΜ的DNA 甲基转移酶抑制剂5 ' -aza-2 ' -deoxyc}ftidine(Sigma Qiemical Co.)处理4天，使细胞株中 原本因甲基化而不表现的基因可重新表现，并WRT-PCR分析基因的表现；使用Qiagen RNeasy kit(Qiagen,Valencia,CA)抽取总RNA(total RNA)，并加入面ase IW去除掉DNA的 污染；每一样本取化g to1:al RNAWSuperscript II反转录酶（reverse hanscriptase)及 6碱基随机引物（random hexamer) (Invihogen)进行cDNA合成；合成的cDNAWPCR master mix reagents kit(Applied Biosystems)进行PCR扩增，并置于溫度循环反应器(thermal cycler,GeneAmp 2400阳，A卵 1 ied Biosystems)中反应，扩增后的cDNA再WRT-PCR分析基 因的表现，各目标基因所使用的RT-PCR引子如表Ξ所示。
[008引表Ξ RT-PCR所使用之MSP引子的序列
[0089]
[0090] 五、人类乳突病毒化PV)的侦测
[0091 ] WLlconsensus PCR及反向线点杂交技术(reverse line blot)侦测鱗状细胞癌 (SCC)中是否有人类乳突病毒化PV)DNA的出现，若有超过该杂交技术分析范围的结果，则W DNA定序确认新型人类乳突病毒(novel HPV type)之序列。
[009引六、统计分析
[0093] W统计软件SAS version 9.1进行数据分析，基因的甲基化与各临床参数(包括 HPV状态)之间的关系，系使用X2测试(X2test)及费雪氏准确检定(Fisher ' S exact test)计 算，并W罗吉斯回归模型（logistic regression model)计算并调整年龄与HPV感染的胜算 比（Odds ratios ,0Rs) W及95% 信赖区间（confidence intervals ,CI )，统计的显着水准 (the al地a level of statistical significance)订为p = 0.05;并计算使用HPV及甲基 化标记(markers)W诊断子宫颈病变的灵敏度(sensitivity)及专一'性(specif icity)。
[0094] 实施例二子宫颈癌甲基化指针基因之筛选
[009引藉由CpG岛微数组(CpG island microarrays)进行差异甲基化杂合反应(DMH)，W 筛选出在子宫颈鱗状细胞癌（SCC)内具有高度甲基化之基因；CpG岛微数组（CpG i Sland microarrays)结果显示，子宫颈癌组织样本与正常子宫颈抹片样本之间，共有216个点具有 差异性甲基化，去除掉序列重复者之后，得到26个基因激活子区域CpG岛(promoter CGIs)。
[0096] 针对运些基因激活子进行定序及分析，并挑选出6个基因，运些基因包含：SOXl (SEQ ID No:l)、PAXl(SEQ ID No:2)、LMXlA(SEQ ID No:3)、NKX6-l(SEQ ID No:4)、WTl (SEQ ID No:5)W及ONECUTUSEQ ID No:6