)，其详细资料如表四所示；由表四可知，运六个 基因都是在发育过程中重要的转录因子（transcription factors)，SOX 1、PAX1、LMX1A、 NKX6-UWT1分别对大脑、神经版(roof plate)、四肢、膜岛W及泌尿生殖器的发育很重要， 0肥CUT1对肝脏及膜脏基因的表现很重要，但目前却很少有研究显示运些基因与癌症的关 连。
[0097] 表四WCpG岛微数组辨识出子宫颈癌细胞中具甲基化的基因之详细资料 [009引
[0099]
[0100] 针对上述各基因转录起始点( + 1)前后各约50化p核巧酸进行CpG序列分析，如图一 所示，各基因中具有CpG序列者W「I J标示，并针对各基因设计其MSP引子(如表一所示)及 亚硫酸盐定序(BS)引子(如表二所示），各目标基因进行甲基化特异性PCR(MSP)W及亚硫酸 盐定序(BS)所合成的片段位置也标示在图一中。
[0101] 接着对混合的子宫颈癌组织样本(30个样本混合)与混合的正常子宫颈抹片样本 (10个样本混合)进行甲基化特异性PCR(MSP)，W确认运6个基因的甲基化现象在不同的组 织样本中是否具有差异，结果如图二所示，运6个基因在混合的子宫颈癌组织样本中均存在 甲基化现象(如图二第2栏所示），而在混合的正常子宫颈抹片样本中则没有甲基化现象(如 图二第1栏所示）；进一步W个别的子宫颈癌组织样本进行测试，取4个子宫颈癌组织样本 (T1、T2、T3、T4)及4个正常样本(N1、N2、N3、N4)进行甲基化特异性PCR(MSP)，分别W可专一 辨认非甲基化基因序列的MSP引子化），W及可专一辨认甲基化基因序列的MSP引子(M)进行 甲基化特异性PCR(MSP)，结果如图Ξ所示，此六个基因在个别的子宫颈癌组织样本中均具 有甲基化现象（如图Ξ第1、3、5、7栏所示），而同样的基因在正常样本中则侦测不到甲基化 现象的发生(如图Ξ第9、11、13、15栏所示）；根据上述结果，将此6个基因作为筛检子宫颈癌 之甲基化指针基因。
[0102] 实施例Ξ子宫颈癌细胞株内DNA甲基化与基因表现的相关性
[0103] 为了确认子宫颈癌甲基化指针基因的表现是否透过DNA甲基化作用来调节，Κ?0μ Μ的DNA甲基转移酶抑制剂5 ' -aza-2 ' -deoxyc}ftidine(AZC) (Sigma 化emical Co .)处理 化La子宫颈癌细胞株4天，再W甲基化特异性PCR(MSP)检查上述6个基因激活子去甲基化的 情况;分别W可专一辨认非甲基化基因序列的MSP引子化），W及可专一辨认甲基化基因序 列的MSP引子（M)进行甲基化特异性PCR(MSP)，结果如图四A所示，未处理5 ' -aza-2 ' - deoxyc}ftidine (AZC)之HeLa子宫颈癌细胞株(AZC-)中，6个目标基因均具有甲基化现象(如 图四A第1栏所示），且侦测不到未甲基化的基因（如图四A第2栏所示）；而在处理5'-aza-2'- deo巧巧tidine(AZC)4天之化La子宫颈癌细胞株(AZC+)中，则可侦测到未甲基化的目标基 因（如图四A第4栏所示），显示经过甲基转移酶抑制剂5 ' -aza-2 '-(16〇巧。八1(1;[]16(42〇处理 后的子宫颈癌细胞株中，上述6个目标基因均有部分已去除甲基化。
[0104] 再WRT-PCR分析运6个基因在化La子宫颈癌细胞株中的表现，结果如图四B所示， 经5 ' -aza-2 ' -deoxyc}ftidine (AZC)处理后的细胞株中，均可侦测到运6个目标基因的mRNA (如图四B第6栏所示），而未经5'-aza-2'-deoxycytidine(AZC)处理的细胞株中，则侦测不 到任何一个目标基因的mRNA(如图四B第5栏所示），由结果可知，运六个目标基因在子宫颈 癌细胞中，确实会经由DNA甲基化作用来调节其基因表现，当基因具有甲基化现象时，基因 的表现会受到抑制，去除甲基化作用之后，目标基因又会开始表现。
[0105] 另W亚硫酸盐定序(BS)分析目标基因在化La子宫颈癌细胞株中是否存在高度甲 基化化ype;rmethylation)现象，结果如图五所示，未经5'-aza-2'-deoxycパidine(AZC)处 理的细胞株（图五A)中，目标基因高度甲基化的样本数比经过5 ' -aza-2 ' -deoxy^tidine (AZC)处理的细胞株（图五B)要来的多；同样W亚硫酸盐定序(BS)分析子宫颈鱗状细胞癌 (SCC)及正常样本，结果则如图六所示，在子宫颈鱗状细胞癌（SCC)(图六A)样本中，目标基 因高度甲基化的样本数也明显较正常样本(图六B)来的多。
[0106] 实施例四临床子宫颈样本内目标基因的甲基化分析
[0107] 请参阅表五，正常样本、低度鱗状细胞上皮内病变化SIL)、高度鱗状细胞上皮内病 变化SIL)W及鱗状细胞癌（SCC)样本的平均年龄分别为51.0±11.3、39.7±9.6、46.4± 14.4 W及53.3± 10.9岁（p<0.05);样本中高危险册V DNA呈现阳性的比率各为：正常样本 21.4%，低度鱗状细胞上皮内病变化SIL)样本47.7%，高度鱗状细胞上皮内病变化SIL)样 本59.3%，鱗状细胞癌(SCC)样本88.9%。结果显示，感染HPV的病患较易罹患不同严重程度 的子宫颈病变化SIUHSIUSCC样本的胜算比各为3.1、5.2、29.9;95%信赖区间各为l.l- 8.3、2.1-13.0、11.5-77.7)。
[0108] 在不同严重程度的子宫颈病变样本中，W甲基化特异性PCR(MSP)分析目标基因的 甲基化状态，目标基因的甲基化状态及人类乳突病毒化PV)的有无之分析结果如表五所示， S0X1、PAX1、LMX1A、NKX6-1、WT1 W及0肥CUT1运6个基因在鱗状细胞癌(SCC)中均具有高频率 甲基化现象，各基因在鱗状细胞癌（SCC)样本中甲基化的比例分别为：81.5%、94.4%、 89.9%、80.4%、77.8% W及20.4%;而在正常子宫颈样本中各基因甲基化的比例则分别 为:2.2%、0%、6.7%、11.9%、11.1%^及0%(口^0.001);因此，与正常子宫颈样本比较， 运6个基因在鱗状细胞癌(see)样本中被甲基化的情况明显高出许多。
[0109] NKX6-1基因甲基化的频率在LSIL样本中为53.3%，在HSIL样本中为55.1%，在see 样本中则为80.4%;统计结果显示，具有NKX6-1基因甲基化现象的病患罹患鱗状细胞癌 (see)的风险较高(胜算比为29.8,95%信赖区间为10.4-85.2)。
[0110] PAX1基因甲基化的频率在LSIL样本中为2.3%，在HSIL样本中为42.1 %，在see样 本中则为94.4%;统计结果显示，具有PAX1基因甲基化现象的病患，罹患高度鱗状细胞上皮 内病变化SIL)及鱗状细胞癌（see)的风险较高化SILW及see样本的胜算比均为>999.9; 95% 信赖区间为 <0.1-〉999.9)。
[0111] S0XULMX1AW及0NECUT1S个基因在癌前病变(precancerous lesions)的样本中 甲基化的频率很低，但在HSIL样本及see样本中甲基化的频率则大幅增加，分别为9.3%及 81.5%、16%及89.9%、7.4%及20.4%;统计结果显示，具有50乂1、11?14或0肥〇]1'1基因甲 基化现象的病患，罹患鱗状细胞癌（see)的风险较高（Ξ者的胜算比分别为200.2、124.5、 7.3;95%信赖区间分别为25.8-999.9、33.0-470.1、2.0-25.9)。
[0112] WT1基因甲基化的频率随着病变严重程度增加而增加，在正常样本中WT1基因甲基 化的频率为11.1 %，在LSIL样本中为20.0 %，在HSIL样本中为42.1 %，在see样本中则为 77.8 % ;统计结果显示，具有WT1基因甲基化现象的病患，罹患高度鱗状细胞上皮内病变 化SIL)及鱗状细胞癌(see)的风险较高佩者的胜算比分别为6.7、27.9;95%信赖区间分别 为2.2-19.8、9.8-78.9)。
[0113] DNA甲基化指针的诊断表现
[0114] 分析DNA甲基化的灵敏度（sensitivity)W及专一'性(specificity)，W决定目标 基因是否可作为高度子宫颈癌病变W及子宫颈癌筛检的生物指针，分析结果如表六所示； WHPV测试来筛检样本有无鱗状细胞癌（see)的灵敏度及专一性分别为83.1 % W及85.5 % (其95% 信赖区间则分别为 77.6-88.5^及79.6-91.4);而分析80乂1、？4乂1、11?心、^?6-1^ 及WT1运5个基因的甲基化状态W筛检鱗状细胞癌（see)的有无，各基因甲基化状态对鱗状 细胞癌(see)的灵敏度则为77.8%-94.4%，其专一性为88.1 %-100 % ;当同时合并HPV测试 与个别甲基化指针基因来检测疾病时山〇11113；[]16(1 parallel testing,CPT)，意即只要HPV测 试或任一甲基化指针基因的测试结果为阳性，则认定该测试样本的子宫颈癌筛检结果为阳 性，其灵敏度介于97.2%-98.2%，而专一性介于66.7%-79.5%;当循序合并（combined sequential testing,CST)HPV测试与个别甲基化指针基因时，意即首先进行HPV测试，并对 HPV测试呈阳性反应之样本进行各指针基因的甲基化状态侦测，其灵敏度介于69.4 % - 85.0%，而所有测试的专一'性均为100%。
[0115] 当同时W高度鱗状细胞上皮内病变化SIL)W及鱗状细胞癌（see)诊断标的时，W HPV测试来筛检样本有无服IL或see的灵敏度及专一性分别为75.0%?及8