包含vegf拮抗剂和抗-ctla-4抗体的组合的方法和组合物的制作方法
【专利说明】包含VEGF拮抗剂和抗-CTLA-4抗体的组合的方法和组合物 发明领域
[0001] 本发明涉及用于治疗癌症及其它疾病和病症的组合治疗。更具体地，本发明涉及 包含VEGF拮抗剂和抗-CTLA-4抗体的治疗组合及其使用方法。
[0002] 发明背景
[0003] 血管内皮生长因子(VEGF)是参与血管生成的细胞因子。配体VEGF-A与VEGF受体-1 (VEGFR1)和VEGFR2相互作用，从而在正常血管和肿瘤血管中引发血管生成信号传导途径。 已知VEGF的拮抗剂可用于治疗许多种疾病和病症，包括癌症、眼睛疾病和与过度的、不需要 的或不适当的血管生成有关的其它状况。VEGF拮抗剂的一个例子是aflibercept(也被称为 VEGF Trap;以.ZALTRAP:? 销售，Regeneron Pharmaceuticals, Inc.，Tarrytown，NY)〇 Aflibercept是基于VEGF受体的嵌合分子，它包含与来自VEGFR2的结构域3融合的来自 VEGFR1的结构域2，结构域3又通过铰链区连接到人I gG 1的Fc (a)结构域。Af 1 i ber c ep t被批 准用于治疗结肠直肠癌并且也正在被开发用于治疗其它癌性状况。VEGF Trap被描述在例 如美国专利号7,070,959中；也参见，Holash et al.，Proc.Natl .Acad. Sci.USA99:11393-11398(2002)。
[0004] 细胞毒性的与T-淋巴细胞有关的抗原-4(CTLA_4)是免疫球蛋白超级蛋白家族的 成员并且参与T-细胞激活的负调节。在T细胞激活时，CTLA-4被上调并且与CD28竞争与B7的 结合，从而为T细胞激活传导抑制信号。已经显示抗CTLA-4的抗体阻断CTLA-4与共激发的分 子B7.1和B7.2(CD80和⑶86)之间的相互作用。这种阻断消除了 T-细胞上CTLA-4-介导的抑 制信号，从而激发抗癌细胞的天然免疫反应。已经显示抗-CTLA-4抗体在临床上治疗例如转 移性黑素瘤是有效的。实例性的抗-CTLA-4抗体包括伊匹木单抗（Yervoy?,Bristol-Myers Squibb,公开在 US6,984,720中）或tremelimumab(Pfizer,公开在 US8,491,895中） 。
[0005] 尽管VEGF拮抗剂和抗-CTLA-4抗体已经个别地显示了在肿瘤和其它癌性状况的治 疗中的巨大前景，但是需要更加定向的、强有力的并且持续的治疗选择来有效地治疗这样 的疾病和病症。因此，在现有技术中对于用于治疗癌症的新治疗方法存在未满足的需要。
[0006] 发明概述
[0007] 根据本发明的一个方面，提供了药物组合物，该药物组合物包含：（i)VEGF拮抗剂； (i i)抗-CTLA-4抗体;和(i i i)药学上可接受的载体或稀释剂。
[0008] 根据本发明的另一个方面，提供了用于抑制或减弱受试者中肿瘤生长的方法。根 据本发明的这个方面所述的方法包括给所述受试者施用治疗有效量的VEGF拮抗剂和治疗 有效量的抗-CTLA-4抗体。
[0009] 根据本发明的另一个方面，提供了用于增长或延长受肿瘤折磨的受试者的存活的 方法。根据本发明的这个方面的方法包括给所述受试者施用治疗有效量的VEGF拮抗剂和治 疗有效量的抗-CTLA-4抗体。
[0010] 根据本发明的另一个方面，提供了用于在受试者中诱导肿瘤免疫的方法。根据本 发明的这个方面的方法包括给所述受试者施用治疗有效量的VEGF拮抗剂和治疗有效量的 抗-CTLA-4抗体。在某些实施方式中，根据本发明的这个方面治疗的受试者，在给所述受试 者施用VEGF拮抗剂和抗-CTLA-4抗体之前或之时，遭受肿瘤折磨。
[0011]关于包括向受试者施用VEGF拮抗剂和抗-CTLA-4抗体的本发明方面，可以以分开 的剂型或以单个剂型（例如联合制剂）向所述受试者施用所述的VEGF拮抗剂和所述的抗_ CTLA-4抗体。正如本文别处所公开的那样，各种定量给药计划和施用方案都被考虑在本发 明的这些方面中。
[0012]被包括在以及被用于本发明的组合物和方法中的VEGF诘抗剂可以是抗-VEGF抗 体、抗-VEGF受体抗体或基于VEGF受体的嵌合分子(VEGF Trap)。在某些实施方式中，所述的 VEGF 诘抗剂是 af 1 ibercept。
[0013 ]被包括在以及被用于本发明的组合物和方法中的抗-CTLA-4抗体可以是拮抗剂抗 体。在某些实施方式中，所述抗-CTLA-4抗体是伊匹木单抗或treme 1 imumab。
[0014] 从随后详细描述的综述中，本发明的其它实施方式将会变为显而易见的。
[0015] 附图简述
[0016] 图1-3举例说明在第0天被植入了Colon-26肿瘤细胞并且在第3、7、10、14和18天通 过注射用所指示的分子组合治疗的小鼠的肿瘤生长和存活结果（〃早治疗肿瘤模型〃）。图1 描绘在植入后在各个时间点不同实验组的肿瘤体积（用mm3表示）。图2显示在植入后第22天 每一个实验组中个别小鼠的肿瘤体积(用mm 3表示）。图3描绘在植入后在各个时间点不同实 验组中小鼠的存活百分数。沿着X轴向上的箭头指示治疗注射的时机。"IgG 〃是IgG2同种型 对照；〃Fc〃是人Fc对照；〃hVGT〃是af libercept(akaVEGF Trap); 〃抗-CTLA-4〃是抗-小鼠 CTLA-4IgG2b 克隆 9D9。
[0017]图4A-4B举例说明在初始的肿瘤激发和用所指示的分子组合治疗，然后在初始肿 瘤植入后第60天用Colon-26肿瘤细胞再激发(没有额外的治疗)后，小鼠中肿瘤体积的测量 值。图4A显示在所述肿瘤再激发后第14天在所指示的实验组(或原始[未治疗的]对照）中个 别小鼠的肿瘤体积（用mm 3表示）；以及图4B显示在所述肿瘤再激发后第32天在所指示的实 验组(或原始[未治疗的]对照）中个别小鼠的肿瘤体积（用mm 3表示），IgG"是IgG2同种型对 照；〃Fc〃是人Fc对照；〃hVGT〃是af libercept(akaVEGF Trap); 〃抗-CTLA-4"是抗-小鼠 CTLA-4IgG2b 克隆 9D9。
[0018] 图5-7举例说明在第0天被植入了Colon-26肿瘤细胞并且在第11、15、17、21和25天 通过注射用所指示的分子组合治疗的小鼠的肿瘤生长和存活结果（〃晚治疗肿瘤模型〃）。图 5描绘在植入后在各个时间点不同实验组的肿瘤体积（用mm3表示）。图6显示在植入后第70 天时所指示的实验组中个别小鼠的肿瘤体积(用_ 3表示）。图7描绘在植入后在各个时间点 不同实验组中小鼠的存活百分数。沿着X轴向上的箭头指示治疗注射的时机。"IgG 〃是IgG2 同种型对照；〃Fc〃是人Fc对照；〃hVGT〃是af libercept(akaVEGF俘获剂）；〃抗-CTLA-4〃是抗-小鼠 CTLA-4IgG2b 克隆 9D9。
[0019] 图8-12举例说明在Colon-26肿瘤植入后第7天开始，在用所指示的单独疗法或组 合疗法或对照组合治疗的小鼠中肿瘤生长、消退、坏死和组织病理学参数。图8描绘在植入 后在各个时间点不同实验组的肿瘤体积（用_ 3表示）。沿着X轴向上的箭头指示治疗注射的 时机。图9显示在植入后第21天时每一个实验组中个别小鼠的肿瘤体积(用mm 3表示）。
[0020] 图10显示在第21天时在每个治疗组中小鼠肿瘤消退的程度(在1至4的分级尺度上 打分）。以H&E切片中受坏死、肿瘤/肿瘤周围浸润液或纤维化影响的肿瘤块的分数的估算值 形式来给肿瘤消退分级。1级= 0-25 %，2级= 25-50 %，3级= 50-75 %，4级= 75-100 %。
[0021]图11显示在第21天时从每个治疗组中的小鼠中采集并且接受组织病理学检查的 肿瘤的肿瘤坏死程度(在1至4的分级尺度上打分）。分级是基于肿瘤块中坏死组织的百分数 的。1级= 0-25 %，2级= 25-50 %，3级= 50-75 %，4级= 75-100 %。
[0022]图12，A_C组分别显示在第21天时每个治疗组中小鼠的炎性细胞浸润液象、肿瘤纤 维化象和有丝分裂象的程度。A组显示炎性细胞浸润液的程度(在1至3的分级尺度上打分）。 1级=很少的小的细胞聚集物/灶，2级=较大的炎性细胞灶，3级=汇合的灶常常变成肿瘤 块边界和内部的局部广泛的淋巴组织细胞浸润液。B组显示肿瘤纤维化的程度(在0至2的分 级尺度上打分）。纤维化分数是基于马森的三色染色剂的：〇级=罕见至偶尔有胶原纤维疏 落在肿瘤处，要么作为肿瘤基质的一部分，要么作为血管周围或与其它结构（例如骨骼肌） 缔合的预先存在的胶原;或者疏落在坏死的区域，在那里偶见的细胶原束被认为是预先存 在的肿瘤基质的部分；1级=细胶原纤维的灶性沉积至灶性广泛性沉积，受限于肿瘤边界， 该边界常常与肿瘤/肿瘤周围浸润液的区域重叠或靠近坏死区域;2级=多灶性的或局部广 泛性的如针对1级所描述的胶原纤维沉积的区域。在肿瘤周围以同心方式沉积的纤维组织 或在真皮中预先存在的胶原纤维没有被包括在所述的估算中。C组显示个别治疗组的有丝 分裂象。将有丝分裂象表示成在每个肿瘤的5个有活力的不相重叠的高倍40倍视野(hpf)中 观察到的有丝分裂象的总数。
[0023]图13和14举例说明在第0天时被植入了 Colon-26肿瘤细胞并且在肿瘤建立后在第 12、15、19、22、26、30、33、37和41天时用所指示的抗-(：1'1^-4抗体(具有18623或186213同种 型）或同种型对照治疗的小鼠的肿瘤生长和存活结果（〃晚治疗肿瘤模型〃）。图13描绘在植 入后在各个时间点不同实验组的肿瘤体积(用mm 3表示）。沿着X轴向上的箭头指示治疗注射 的时机。图14描绘在植入后在各个时间点不同实验组中小鼠的存活百分数。
[0024]图15-17举例说明在第0天时被植入了MC38肿瘤细胞并且在肿瘤建立后在第10、 14、17、21和24天时用所指示的抗-(：1'1^-4抗体(具有以62&或186213同种型)或同种型对照治 疗的小鼠的肿瘤生长和存活结果("晚治疗肿瘤模型"）。图15描绘在植入后在各个时间点不 同实验组的肿瘤体积（用mm 3表示）。沿着X轴向上的箭头指示治疗注射的时机。图16显示在 植入后在第21天时所指示的实验组中个别小鼠的肿瘤体积（用mm 3表示）。图17描绘在植入 后在各个时间点不同实验组中小鼠的存活百分数。
[0025] 图18和19举例说明在第0天时被植入了 MC38肿瘤细胞并且在第15、17、23、25、27、 33、35和7天时通过注射用所指示的分子组合治疗的小鼠肿瘤生长的结果（〃晚治疗肿瘤模 型〃）。图18描绘在植入后在各个时间点不同实验组的肿瘤体积（用mm 3表示）。图19显示在植 入后在第24天时所指示的实验组中个别小鼠的肿瘤体积（用mm3表示），IgG2a 〃是IgG2a同 种型对照；〃Fc〃是人Fc对照；〃hVGT〃是af libercept(akaVEGF Trap); 〃抗-CTLA-4IgG2a〃是 具有I gG2a同种型的抗-小鼠 CTLA-4抗体。
[0026] 图20和21举例说明在第0天时被植入了MC38肿瘤细胞并且在第10、14、18、21和25 天时通过注射用所指示的分子组合治疗的小鼠的肿瘤生长结果（〃晚治疗肿瘤模型〃）。图20 描绘在植入后在各个时间点不同实验组的肿瘤体积（用mm 3表示）。图21显示在植入后在第 18天时所指示的实验组中个别小鼠的肿瘤体积(用mm3表示）。
[0027]图22举例说明在第0天时被植入了MC38肿瘤细胞并且在第9、13、16和20天时通过 注射用所指示的分子组合治疗的小鼠的肿瘤生长结果（肿瘤体积[用mm3表示])(〃晚治疗肿 瘤模型〃）。
[0028] 图23、24和25描绘血管生成标记基因 D114(图23)、Ang2(图24)和Robo4(图25)的相 对表达水平，正如在用所指示的分子组合治疗后，通过对从小鼠获得的已经建立的肿瘤的 实时PCR分析所测定的那样。
[0029]图26描绘E-选择蛋白的相对表达水平，正如在用所指示的分子组合治疗后，通过 对从小鼠获得的已经建立的肿瘤的实时PCR分析所测定的那样。
[0030] 图27和28分别描绘CD8和CD247的相对表达水平，正如在用所指示的分子组合治疗 后，通过对从小鼠获得的已经建立的肿瘤的实时PCR分析所测定的那样;它们的表达反映各 个治疗组中浸润肿瘤的淋巴细胞的表达水平。
[0031] 图29和30分别描绘炎性细胞因子IFNy和TNFa的相对表达水平，正如在用所指示 的分子组合治疗后，通过对从小鼠获得的已经建立的肿瘤的实时PCR分析所测定的那样。 [0032]图 31、32和33分别描绘1七83111(〇)1113)』11^1$4/80)和^831(〇)11(3)的相对表达水 平，正如在用所指示的分子组合治疗后，通过对从小鼠获得的已经建立的肿瘤的实时PCR分 析所测定的那样;它们的表达反映各个治疗组中骨髓细胞浸润液的水平(分别是骨髓细胞、 巨噬细胞和树突细胞）。
[0033] 详细描述
[0034] 在描述本发明之前，应该理解本发明不限于所描述的具体方法和实验条件，因为 这样的方法和条件可以变化。也应该理解本文所用的术语仅仅用于描述【具体实施方式】的目 的，并不想要限定本发明的保护范围，因为本发明的保护范围仅仅由所附的权利要求来限 定。
[0035] 除非以其它方式定义，本文中使用的所有科技术语具有与本领域普通技术人员通 常所理解的相同的意义。正如本文