续30秒。按照下列方式计算每种基因的mRNA水平的比例：（每种基因的绝对拷贝 数)/(亲环蛋白B的绝对拷贝数）。
[0150] 将结果表示成平均值+/_标准误差，并且使用带有Tukey的多重比较检验的普通单 向AN0VA来评价统计学显著性。小于0.05的值被认为是统计学上显著的。*P〈0.05;**P〈 0·005;***P〈0·0005;****P〈0·0001。
[0151] 与对照相比，采用抗-CTLA-4抗体或VEGF-Trap对已经建立的MC38肿瘤的体内治疗 导致对肿瘤生长的显著性抑制（图22,分别是实心方块和空心圆圈〇）。采用这两种药剂 阻断进一步减少了 MC38肿瘤生长，显示了组合抗肿瘤效果（图22,实心三角A)。
[0152] 对肿瘤RNA的实时PCR分析已经显示出抗-血管生成剂VEGF-Trap下调血管生成标 记基因 D114、Ang2和Robo4的表达，然而抗-CTLA-4疗法没有影响这些基因（分别是图23、24 和25) JEGF-Trap与抗-CTLA-4Ab的组合显著地增大了E-选择蛋白的水平（图26)，这表明了 内皮细胞的激活，该激活反映了淋巴细胞向肿瘤迀移的改善的能力。
[0153] 为了评估抗肿瘤免疫反应，还利用实时PCR分析来评估浸润肿瘤的淋巴细胞的表 达。尽管VEGF-Trap并不影响T淋巴细胞募集，但是抗-CTLA-4Ab疗法实质性地增大了⑶8+和 CD3+T细胞(CD247)的数目，在所述的组合组中，这些细胞的数目被进一步增加了（图27和 28)。使用抗-CTLA4Ab但是不使用VEGF-Trap的治疗，也导致Treg细胞标记物叉头盒蛋白3 (FoxP3)增加的表达(没有显示）。
[0154] 通过评估炎性细胞因子的表达进一步分析了肿瘤免疫环境。抗-CTLA4抗体和所述 的组合治疗显著地增加了干扰素 （IFN γ )和肿瘤坏死因子(TNFa)的水平，然而VEGF-Trap单 一疗法没有这些效果中的任何一种(分别是图29和30)。
[0155] 为了分析骨髓细胞浸润液，评估了分别作为骨髓细胞、巨噬细胞和树突细胞的标 记物的Itgam(O)llb)、Emrl(F4/80)和]^881(0)11(3)的1111?祖水平。抗-(711^\4抗体或所述的组 合疗法促进了骨髓细胞浸润液的显著增加（图31、32和33)，在所述的组合组中，浸润到肿瘤 中的树突细胞有最突出的增加。
[0156] 总的来说，这个实施例进一步证明了抗-CTLA4抗体和VEGF-Trap针对已经建立的 肿瘤的显著的组合效果。对被治疗的肿瘤的分子免疫概况分析提示:抗-CTLA4和VEGF-Trap 疗法分别通过调节免疫调制和血管生成的信号途径而介导它们的效应，在所述的组合组 中，这两者可能都对改善的抗肿瘤免疫反应有贡献。施用VEGF-Trap显示了激活的内皮和血 管生成因子D114、Ang2和Robo4的下调。在所述的组合组中E-选择蛋白的增强的表达可能指 示改善的淋巴细胞粘着和滚动，该粘着和滚动可能导致增强的淋巴细胞向肿瘤组织中的浸 润。这个结果与增加的T细胞和骨髓细胞数目以及在抗-CTLA-4治疗的肿瘤中观察到的炎性 细胞因子的上调和在所述的组合组中进一步增加相一致，这指示了对于双重的VEGF和 CTLA-4阻断的抗肿瘤免疫反应的协同性。
[0157] 本发明在保护范围方面不限于本文中描述的【具体实施方式】。实际上，从前述的描 述和附图出发，除了本文中描述的那些修饰以外，对本发明的各种修饰对于本领域普通技 术人员来说将会变成显而易见的。预期这样的修饰也落入了所附的权利要求书的保护范围 里。
【主权项】
1. 一种药物组合物，其包含：（i)VEGF拮抗剂；（i i)抗-CTLA-4抗体;和（ii i)药学上可接 受的载体或稀释剂。2. 权利要求1所述的药物组合物，其中所述的VEGF拮抗剂包含选自由下列组成的组的 分子:抗-VEGF抗体和抗-VEGF受体抗体。3. 权利要求1所述的药物组合物，其中所述的VEGF拮抗剂包含基于VEGF受体的嵌合分 子（VEGF Trap)。4. 权利要求3所述的药物组合物，其中所述的VEGF Trap包含VEGFR1的一个或更多个免 疫球蛋白（Ig)-样的结构域、VEGFR2的一个或更多个Ig-样结构域和多聚化结构域。5. 权利要求4所述的药物组合物，其中所述的VEGF Trap包含VEGFR1的Ig-样结构域2、 VEGFR2的Ig-样结构域3和多聚化结构域。6. 权利要求5所述的药物组合物，其中所述的VEGF Trap包含：（1 )VEGFR1组件，其包含 SEQ ID N0:2的氨基酸27-129;(2)VEGFR2组件，其包含SEQ ID N0:2的氨基酸 130-231;和 (3)多聚化组件，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸232-457。7. 权利要求6所述的药物组合物，其中所述的VEGF Trap包含由SEQ ID NO: 1的核酸序 列编码的VEGFR1R2-Fc Δ Cl (a)。8. 权利要求1-7中的任意一项所述的药物组合物，其中所述的抗-CTLA-4抗体是拮抗剂 抗体。9. 权利要求1 _7中的任意一项所述的药物组合物，其中所述的抗-CTLA-4抗体是伊匹木 单抗或 treme 1 imumab 〇10. 用于在受试者中抑制或减轻肿瘤生长的方法，该方法包括给所述受试者施用治疗 有效量的VEGF拮抗剂和治疗有效量的抗-CTLA-4抗体。11. 权利要求10所述的方法，其中以分开的剂型给所述受试者施用所述的VEGF拮抗剂 和抗-CTLA-4抗体。12. 权利要求11所述的方法，其中同时给所述受试者施用所述分开的剂型。13. 权利要求11所述的方法，其中顺序地给所述受试者施用所述分开的剂型。14. 权利要求10所述的方法，其中以单一剂型给所述受试者施用所述VEGF拮抗剂和抗_ CTLA-4 抗体。15. 权利要求10-14中的任意一项所述的方法，其中对所述受试者静脉内或皮下施用所 述VEGF拮抗剂。16. 权利要求10-15中的任意一项所述的方法，其中对所述受试者静脉内或皮下施用所 述的抗-CTLA-4抗体。17. 权利要求10-16中的任意一项所述的方法，其中所述的VEGF拮抗剂包含选自由下列 组成的组的分子:抗-VEGF抗体和抗-VEGF受体抗体。18. 权利要求10-16中的任意一项所述的方法，其中所述的VEGF拮抗剂包含基于VEGF受 体的嵌合分子(VEGF Trap)。19. 权利要求18所述的方法，其中所述的VEGF Trap包含VEGFR1的一个或更多个免疫球 蛋白（Ig)_样结构域、VEGFR2的一个或更多个Ig-样结构域和多聚化结构域。20. 权利要求19所述的方法，其中所述的VEGF Trap包含VEGFR1的Ig-样结构域2、 VEGFR2的Ig-样结构域3和多聚化结构域。21. 权利要求20所述的方法，其中所述的VEGF Trap包含：（1 )VEGFR1组件，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸27-129;(2)VEGFR2组件，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸130-231;和（3)多 聚化组件，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸232-457。22. 权利要求21所述的方法，其中所述的VEGF Trap包含由SEQ ID NO: 1的核酸序列编 码的VEGFR1R2-FC Δ Cl (a)。23. 权利要求10-22中的任意一项所述的方法，其中所述的抗-CTLA-4抗体是拮抗剂抗 体。24. 权利要求10-22中的任意一项所述的方法，其中所述的抗-CTLA-4抗体是伊匹木单 抗或 treme 1 imumab 〇25. 用于增长或延长遭受肿瘤折磨的受试者存活的方法，所述的方法包括给所述受试 者施用治疗有效量的VEGF拮抗剂和治疗有效量的抗-CTLA-4抗体。26. 权利要求25所述的方法，其中以分开的剂型给所述受试者施用所述的VEGF拮抗剂 和抗-CTLA-4抗体。27. 权利要求26所述的方法，其中同时给所述受试者施用所述的分开的剂型。28. 权利要求26所述的方法，其中顺序地给所述受试者施用所述的分开的剂型。29. 权利要求25所述的方法，其中以单一剂型给所述受试者施用所述的VEGF拮抗剂和 抗-CTLA-4抗体。30. 权利要求25-29中的任意一项所述的方法，其中对所述受试者静脉内或皮下施用所 述的VEGF拮抗剂。31. 权利要求25-30中的任意一项所述的方法，其中对所述受试者静脉内或皮下施用所 述的抗-CTLA-4抗体。32. 权利要求25-31中的任意一项所述的方法，其中所述的VEGF拮抗剂包括选自由下列 组成的组的分子:抗-VEGF抗体和抗-VEGF受体抗体。33. 权利要求25-31中的任意一项所述的方法，其中所述的VEGF拮抗剂包含基于VEGF受 体的嵌合分子(VEGF Trap)。34. 权利要求33所述的方法，其中所述的VEGF Trap包含VEGFR1的一个或更多个免疫球 蛋白（Ig)_样结构域、VEGFR2的一个或更多个Ig-样结构域和多聚化结构域。35. 权利要求34所述的方法，其中所述的VEGF Trap包含VEGFR1的Ig-样结构域2、 VEGFR2的Ig-样结构域3和多聚化结构域。36. 权利要求34或权利要求35所述的方法，其中所述的VEGF Trap包含：（1 )VEGFR1组 件，其包含SEQ ID N0:2的氨基酸27-129;(2)VEGFR2组件，其包含SEQ ID N0:2的氨基酸 130-231;和(3)多聚化组件，其包含SEQ ID N0:2的氨基酸232-457。37. 权利要求36所述的方法，其中所述的VEGF Trap包含由SEQ ID NO: 1的核酸序列编 码的VEGFR1R2-Fc Δ Cl (a)。38. 权利要求25-37中的任意一项所述的方法，其中所述的抗-CTLA-4抗体是拮抗剂抗 体。39. 权利要求25-37中的任意一项所述的方法，其中所述的抗-CTLA-4抗体是伊匹木单 抗或 treme 1 imumab 〇40. 用于在受试者中诱导肿瘤免疫的方法，所述的方法包括给所述受试者施用治疗有 效量的VEGF拮抗剂和治疗有效量的抗-CTLA-4抗体。41. 权利要求40所述的方法，其中在给所述受试者施用所述的VEGF拮抗剂和抗-CTLA-4 抗体之前，所述受试者遭受肿瘤折磨。42. 权利要求40或41所述的方法，其中以分开的剂型给所述受试者施用所述的VEGF拮 抗剂和抗-CTLA-4抗体。43. 权利要求42所述的方法，其中同时给所述受试者施用所述的分开的剂型。44. 权利要求42所述的方法，其中顺序地给所述受试者施用所述分开的剂型。45. 权利要求40或41所述的方法，其中以单一剂型给所述受试者施用所述的VEGF拮抗 剂和抗-CTLA-4抗体。46. 权利要求40-45中的任意一项所述的方法，其中对所述受试者静脉内或皮下施用所 述的VEGF拮抗剂。47. 权利要求40-46中的任意一项所述的方法，其中对所述受试者静脉内或皮下施用所 述的抗-CTLA-4抗体。48. 权利要求40-47中的任意一项所述的方法，其中所述的VEGF拮抗剂包含选自由下列 组成的组的分子:抗-VEGF抗体和抗-VEGF受体抗体。49. 权利要求40-47中的任意一项所述的方法，其中所述的VEGF拮抗剂包含基于VEGF受 体的嵌合分子(VEGF Trap)。50. 权利要求49所述的方法，其中所述的VEGF Trap包含VEGFR1的一个或更多个免疫球 蛋白（Ig)_样结构域、VEGFR2的一个或更多个Ig-样结构域和多聚化结构域。51. 权利要求50所述的方法，其中所述的VEGF Trap包含VEGFR1的Ig-样结构域2、 VEGFR2的Ig-样结构域3和多聚化结构域。52. 权利要求51所述的方法，其中所述的VEGF Trap包含：（1) VEGFR1组件，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸27-129;(2)VEGFR2组件，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸130-231;和（3)多 聚化组件，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸232-457。53. 权利要求52所述的方法，其中所述的VEGF Trap包含由SEQ ID NO: 1的核酸序列编 码的VEGFR1R2-Fc Δ Cl (a)。54. 权利要求40-53中的任意一项所述的方法，其中所述的抗-CTLA-4抗体是拮抗剂抗 体。55. 权利要求40-53中的任意一项所述的方法，其中所述的抗-CTLA-4抗体是伊匹木单 抗或 treme 1 imumab 〇56. 权利要求1 -8中的任意一项所述的药物组合物，其中所述的抗-CTLA-4抗体具有Fc 同种型，该Fc同种型提供ADCC和⑶C效应子活性。57. 权利要求56所述的药物组合物，其中所述的抗-CTLA-4抗体是IgGl同种型的。58. 权利要求10-23、25-38或40-54中的任意一项所述的方法，其中所述的抗-CTLA-4抗 体具有Fc同种型，该Fc同种型提供ADCC和⑶C效应子活性。59. 权利要求58所述的方法，其中所述的抗-CTLA-4抗体是I gG 1同种型的。
【专利摘要】本发明提供包含VEGF拮抗剂和抗-CTLA-4抗体的药物组合物以及使用它的方法。本发明的组合物和方法可用于治疗癌症和其它疾病和病症，其中抗血管生成疗法和/或靶向的免疫反应可能是有益的。
【IPC分类】C07K16/28, A61K39/00, A61K39/395, A61K38/17
【公开号】CN105636986
【申请号】CN201480054902
【发明人】E·约费, I·洛伊, G·瑟斯顿, E·布罗瓦
【申请人】瑞泽恩制药公司
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2014年10月17日
【公告号】CA2926853A1, WO2015058048A1