作为癌症治疗的新方法的p53聚集的基于结构的肽抑制剂的制作方法
【专利说明】作为癌症治疗的新方法的P53聚集的基于结构的肽抑制剂
[0001 ]本申请要求2013年5月8日提交的美国临时申请系列号61/821，157的提交日期的 权益，所述美国临时申请通过引用整体并入本文。
[0002] 本发明是在由国家科学基金授予的第NSF MCB-0958111号基金下在政府支持下进 行的。政府在本发明中具有某些权利。
[0003] 序列表
[0004] 本申请含有以ASCII格式电子提交并由此通过引用整体并入的序列表。2014年5月 8日创建的所述ASCII拷贝被命名为58086-364665_SL.txt并且大小为24,636字节。
[0005]背景信息
[0006] 肿瘤抑制基因 （tumor suppressor)p53中的突变与所有报道的人癌症的50%相关 (5〇1188；[等，2006)<^53突变体的结构不稳定性导致部分解折叠(131111001^和?6^111:，2001)， 这进而可引起P53形成与在淀粉样蛋白病诸如阿尔茨海默病中看到的那些聚集体相似的聚 集体(Xu等，2011 ;Levy等，Eisenberg和Jucker，2012) <φ53错折叠和聚集的过程导致蛋白质 失活，从而从其保护功能消除了'基因组卫士(guardian of the genome)'（Xu等，2011)。
[0007] 在过去的数十年中，已显示几种不同的p53突变，特别地被认为是"结构突变"的那 些突变影响p53折叠，从而降低蛋白质的稳定性和诱导部分解折叠（Builock和Fersht， 2001)。已通过使用突变体特异性抗体PAb240在在癌症活检组织中演示了这些异常的p53构 象，所述抗体识别埋藏在蛋白质核心中的表位，该表位只有在错折叠后才暴露于溶剂 (Gannon等，1990)。另外，一些证据已表明，p53蛋白的片段（Ishimaru等，Biochemistry 2003; Silva等，2010; Ishimaru等，2009 ;Galea等，2005;Rigacci等，2008)以及全长突变型 p53蛋白（Wang等，PNAS，2012)在体外经历淀粉样蛋白聚集。另外，据报道P53以错误折叠的 聚集的淀粉样状态存在于来源于乳腺癌病例(Levy等，2011)以及结肠癌(Xu等，2011)和基 底细胞癌（!^1838仙-1^6￥68等，2013)的活检组织中 。
[0008] 存在对可特异性破坏P53聚集体或防止它们形成的试剂，特别是在基于合理结构 的方法中设计的，用于治疗其中P53因其被异常折叠和/或聚集(被发现呈纤维形式的无活 性的）的事实而失活的癌症形式的试剂的需要。由于所有诊断的肿瘤的约一半呈现P53突 变，因此此类靶向治疗剂的适用性的潜力是巨大的。
[0009] 附图简述
[0010] 本专利或申请文件包含至少一个彩色绘图。
[0011] 里1显示P53的淀粉样蛋白易聚区段的两个多形体即P53残基253-258(序列： TΠTLE(SEQIDN0:20))和p53残基252-258(序列：LTΠTLE(SEQIDN0:21))的X射线高分 辨率结构。在两种情况下，原丝由两个相互交叉的β折叠组成，具有紧密干燥的界面。显示了 三层折叠;水分子显示为黄色球体。顶视图是沿纤维轴（指示为红色菱形），而底部视图垂直 于轴线(红色箭头）。
[0012] 图2显示基于ρ53252-258晶体结构建模的INH-1R。呈现3个相邻的折叠。青色球-和-棒状抑制剂与LTIITLE(SEQ ID Ν0:21)结构具有高表面互补性。INH-1R的精氨酸(黄色）与 相对的β折叠触碰，从而抑制进一步的纤丝生长。所述抑制剂可结合立体拉链模板的顶部 和/或底部(沿纤维轴）。视图是沿着纤维轴的。
[0013] 图3显示了 INH-1R对p53聚集（区段p53252-258)的体外抑制。通过硫磺素 T测定（因递 增量的染料可特异性结合的淀粉样蛋白的形成而随时间检测到硫磺素 T荧光的增加)监测 P53的聚集。将INH-1R以不同的浓度添加在溶液中，并且所述INH-1R能够以浓度依赖性方式 延迟聚集发生和降低存在的聚集体的总量。该区段LTIITLE的序列为SEQ ID N0:21.
[0014] 图4显示INH-1R(1NH-1R CPP)的细胞穿透形式能够进入人癌细胞。INH-1R CPP被 共价连接至FITC荧光标记，并被添加至从卵巢癌患者直接获得的不同癌细胞系或原代细胞 (如此处所描述的KA.肽成功地穿透进入细胞的细胞溶质和细胞核（绿色)并且与p53共定 位。细胞核用Hoechst 33342(蓝色)进行染色，而p53蛋白通过抗p53抗体来识别并且被染成 红色。B.所述肽与蛋白质聚集体在相同的细胞中共定位。蛋白聚集体用商购可得的0C抗体 (呈红色)来进行染色。这表示INH-1R CPP结合这些卵巢癌细胞中的聚集的p53。
[0015] 趣显示INH-1R CPP引起p53的再定位，并且破坏聚集。在顶图中，来自浆液性卵巢 癌患者的原代细胞的P53染色显示斑点状p53的细胞溶质染色。在用ΙΟμΜ的INH-1R CPP处理 24小时后，所有斑点消失，并且ρ53现已扩散并定位于细胞核，在所述细胞核中其可发挥其 转录因子和肿瘤抑制因子的功能，如可在底图中看见的。再次地，INH-1R CPP与ρ53共定位 (INH-1R CPP呈绿色，ρ53呈红色，细胞核呈蓝色）。
[0016] _显示INH-1R CPP导致错误折叠的Ρ53以获得野生型样功能性折叠。来源于卵巢 癌肿瘤的稳定细胞系用商购可得的D0-1抗体进行染色，所述抗体识别任何ρ53而不论其结 构状态。如图5中所示，利用抑制剂而非利用无规则肽的处理引起ρ53再定位于细胞核。在底 图中，转换伴随着重折叠步骤:在用抑制剂处理后，抗体PAb240不结合这些细胞中的ρ53，尽 管 Ρ53基因丰富地存在(见上述D0-1染色）。？六匕240商业抗体识别错误折叠的ρ53基因，从而 PAb240抗原性的损失反映 ρ53群体从错误折叠至正确折叠的具有功能的蛋白质的变化。
[0017] 图7显示INH-1R CPP处理的细胞具有可响应生理调节系统的功能性ρ53。通过蛋白 质印迹评估用〇、1、5或ΙΟμΜ INH-1R处理24小时的0VCAR-3细胞裂解物中的ρ53水平，并使用 ImageJ进行定量。当1NH-1R CPP处理时，ρ53的总量以浓度依赖性方式减少。正确折叠的ρ53 (参见图6)现可如WT ρ53-样被降解。因错折叠/聚集而导致的超稳定丧失，并且蛋白质转 换快。
[0018] 图8显示INH-1R CPP CPP有效地诱导具有错误折叠/易聚集突变型ρ53的肿瘤细胞 的细胞死亡。Α.在利用ΙΟμΜ INH-1R CPP处理24小时的细胞中检测到细胞活力的剂量依赖 性减小。对于递增的INH-1R CPP剂量观察到增加的细胞凋亡(Β.)和减少的增殖(C.)』.和 C.显示来自卵巢癌的原代细胞的一个代表性案例。对于所有敏感性原代细胞以及细胞系观 察到类似结果。
[0019] 图9显示INH-1R CPP有效地诱导癌细胞的细胞死亡。用胰蛋白酶处理利用INH-1R 或对照肽处理24小时的细胞，并通过FACS分析所述细胞。相较于媒介物处理的细胞(DMS0)， 细胞死亡伴随着细胞尺寸的典型减小和利用INH-1R CPP处理的细胞的粒度的增加。利用对 照无规则肽序列处理的癌细胞不显示细胞尺寸或粒度的任何变化。
[0020] 图10显示利用INH-1R CPP处理的癌细胞的细胞凋亡和坏死。利用指定浓度的INH-1R CPP或无规则抑制剂序列处理0VCAR-3细胞24小时。Hoechst(蓝色)将所有细胞核染色， 然而Y0-PR0-1(绿色）只将凋亡细胞染色，以及碘化丙啶(红色)将晚期凋亡/坏死细胞染色。 利用抑制剂处理的样品主要含有死细胞，而无规则肽没有作用，表明序列特异性作用。
[0021] 图11显示INH-1R CPP诱导p53靶基因 p21和Mdm2的上调。INH-1R CPP的特异性和功 效通过只有含有P53错误折叠/聚集突变的肿瘤细胞中上调p53靶基因来确认。
[0022] 图12显示INH-1R CPP在体内限制肿瘤增殖。A.利用INH-1R CPP、无规则肽对照或 媒介物处理14天的来自小鼠（对于每一个组n = 3,一只小鼠具有2个异种移植物）的异种移 植物的图像。B.利用INH-1R CPP处理的小鼠的肿瘤为对照的1 /6，如通过重量评估的。C.每 日评估肿瘤体积。D.来自INH-1R CPP处理的动物的残余肿瘤显示p53靶基因 MDM2和p21的上 调。
[0023] 图13显示如通过MRM(多反应监测）质谱测量的INH-1R CPP的血清浓度。用0VCAR-3 细胞在侧腹注射裸鼠，并使所得的异种移植物生长两周。随后利用15mg/kg的INH-1R CPP肽 或无规则对照肽通过IP处理裸鼠3天。将它们分入两组，并在最后一次肽注射后1、2、4、8、12 小时和24小时将其处死。在处理前处死两只首次接受实验的小鼠以获得参照值。在注射后1 小时检测到INH-1R CPP(以及对照肽）的血清峰浓度。显示了示两只小鼠的平均值。
[0024] 描述
[0025]本申请涉及例如肽的设计、合成和功能性表征，所述肽特异性(优先)结合具有异 常(例如病理学)构象的P53蛋白分子并恢复具有所述异常构象的p53的分子的构象。所述异 常构象可以是，例如，由分子的突变或其它因素引起的分子的错误折叠，或野生型或突变型 P53分子的淀粉状蛋白聚集体的形成。作为构象的恢复的结果，由于异常构象而丧失或被抑 制的生物学或生物化学活性被重新激活或恢复。例如，所述抑制肽可抑制(阻断)p53淀粉样 蛋白聚集体的进一步聚集和/或恢复P53功能，诸如，例如细胞凋亡的诱导或抑制、细胞增 殖的抑制，和/或诱导肿瘤的缩小。在一些实施方案中，将所述肽与增强它们至细胞内的递 送的细胞穿透肽(CPP)融合。
[0026]本发明人最近显示，有可能利用被设计来将正在生长的聚集体特异性"加帽"的短 的氨基酸抑制剂高效地阻止阿尔茨海默病相关蛋白τ和精液源性HIV病毒感染增强因子 (SEVI)的聚集(Sievers等，2011)。因此，存在将新的治疗窗，所述治疗窗靶向似乎对癌症进 展具有深远影响的P53生物学的完全未开发的方面，即导致聚集的p53的错折叠。本发明人 推测，突变、过表达或其它细胞因子使天然P53的结构去稳定，从而暴露具有粘性的"立体拉 链"区段，该区段被提出作为淀粉样蛋白聚集体的基本结构单元(Nelson等，Nature ,2005， Sawaya等，Nature，2007)。如本文中所报道的，本发明人因此获得p53聚集体的淀粉样蛋白 脊(amyloid spine)的高原子分辨率的视图，并将它们用作模板来开发基于结构的肽抑制 剂，所述抑制剂可为所述聚集体加帽，进一步抑制P53聚集，并从而产生可使癌细胞对治疗 敏感和诱导或起始细胞凋亡的活性P53的汇集物。p53蛋白聚集的这些合理的基于结构的抑 制剂提供了高效地针对已证明是最具侵袭性并且因 P53的聚集状态而对标准治疗具有弹性 的那些肿瘤的新的化学疗法(Xu等，2011; Levy等2011)。
[0027]本申请涉及，例如，此类抑制肽;其中本发明的抑制肽与细胞穿透肽(CPP)融合的 分子，所述融合分子有时在本文中被称为"CPP抑制剂"；包含本发明的抑制肽或CPP抑制剂 和药学上可接受的载体的药物组合物;使用抑制肽或CPP抑制剂来恢复具有异常构象的P53 分子的结构和功能，例如(a)阻断或抑制p53聚集(例如，以在溶液中，细胞中或具有包含p53 聚集体的癌症或肿瘤的受试者中延迟聚集的发生和/或降低聚集的量），和/或(b)恢复错误 折叠的P53的折叠，从而重新激活因异常构象而导致的p53的生物学或生物化学活性的方 法；用于治疗具有包含聚集的p53(例如，野生型或突变型聚集的p53)的肿瘤的受试者的方 法，包括向所述受试者施用有效量的本发明的CPP抑制剂或使所述肿瘤与本发明的所述CPP 抑制剂接触;和计算机相关的实施方案，诸如用于设计和获得基于本文所述的晶体结构的 结构示意图的抑制肽或小分子的方法。
[0028]本发明的抑制肽和CPP抑制剂的优点包括：（1)它们只对含有突变型或野生型聚 集的P53或错误折叠的p53的那些癌细胞具有选择活性；（2)它们对折叠的且具有活性的p53 (在正常细胞中不存在P53的过度活化或p53浓度的增加)没有影响；（3)它们是构象特异性 的，而非序列（如突变)特异性的。单一抑制剂将对不同的聚集突变体以及野生型P53起作 用；（4)它们可阻断野生型p53的共聚集以及p53与同源蛋白质和其它蛋白质(包括例如，p63 和p73，p53蛋白家族的其它成员）的聚集(Xu等，2011); (5)由于它们的组成和尺寸，细胞穿 透和蛋白质稳定性不是挑战性障碍；（6)它们出乎意料地稳定:它们不被蛋白水解并且显示 足够长的在体内（例如在身体中）发挥作用的半衰期。
[0029]本发明的一个方面是由共有序列[L，Y，E，W]T[R，K]，IT[L，Y]E(SEQIDN0:1)S 其活性变体所示的抑制肽（例如，分离的肽）。在一个实施方案中，所述抑制肽由共有序列 [L，Y，E，W]T R I T[L，Y]E(SEQ ID勵:3)或其活性变体表示。所述抑制肽可由共有序列[1^， Y，E，W]T[R，K]，I T[L，Y]E(SEQ ID N0:1)组成，或其可由共有序列[L，Y，E，W]T R I T[L，Y] E(SEQ ID N 0:3)组成。在本发明的实施方案中，抑制肽可由表1中所列的任何抑制肽序列 组成或包含所述抑制肽序列。即，所述肽可以是LTRITLE(SEQ ID N0:4)、YTRITLE(SEQ ID N0:5)、ETRITLE(SEQ ID N0:6)、LTRIYLE(SEQ ID N0:7)、YTRIYLE(SEQ ID N0:8)、WTRITLE (SEQ ID N0:9)、WTRIYL E(SEQ ID N0:10)、ETRIYLE(SEQ ID N0:11)、LTKITLE(SEQ ID NO: 12)、YTKITLE(SEQ ID N0:13)、WTKITLE(SEQ ID N0:14)、ETKITLE(S EQ ID N0:15)、 LTKIYLE(SEQ ID N0:16)、YTKIYLE(SEQ ID N0:17)、WTRIYLE(SEQ ID N0:10)、ETKIYLE(SEQ ID NO: 18)。具有前述序列的抑制肽，包括活性变体，有时在本文中被称为"本发明的抑制 肽。"
[0030] 本发明的另一个方面是包含任选地通过接头序列与细胞穿透肽(CPP)融合的（连 接的、缔合的、偶联的)本发明的抑制肽(包括活性变体)的CPP抑制剂。可以以多种方式中的 任何方式(例如化学偶联，或通过肽键或其它常规化学偶联方法的融合)将肽与CPP融合。
[0031] 在一个实施方案中，CPP由共有序列（Ri-16)P I[L，Y，E，W]T[R，K]，I T[L，Y]E(SEQ ID NO: 19)或其活性变体表示。包含被该共有序列或其活性变体涵盖的序列的CPP抑制剂在 本文中有时被称为"本发明的CPP抑制剂"。
[0032] 本发明的另一个方面是包含本发明的抑制肽或CPP和药学上可接受的载体的药物 组合物。此类药物组合物在本文中有时被称为"本发明的药物组合物"。
[0033]如本文中所用，除非上下文中另外明确指定，否则单数形式"一种/一个(a)"、"一 种/一个(an)"和"该(the)"包括复数指示物。例如，在先前的案例中，所述药物组合物可包 含本发明的一种或多种抑制肽分子或CPP，其可以相同或不同。
[0034]本发明的另一个方面是包含p53蛋白分子和本发明的抑制肽或CPP的复合物。它们 可彼此结合、彼此缀合或以另外方式彼此缔合。可共价或非共价地连接P53和抑制肽或CPP。
[0035]本发明的另一个方面是用于恢复具有异常构象(例如其中异常构象至少部分是蛋 白质功能丧失的原因）的P53蛋白分子的构象的方法，其包括
[0036]将具有异常构象的p53分子与有效量的本发明的抑制肽或CPP抑制剂接触，接触的 P53具有恢复的构象，
[0037]其中具有恢复的构象的p53分子显示选自细胞凋亡的诱导、细胞增殖的抑制和/或 肿瘤缩小的诱导的活性(例如恢复的活性）。
[0038] 在本方法的一个实施方案中，被接触的p53蛋白分子存在于具有癌症的受试者中， 并且具有恢复的构象的P53分子在受试者中抑制癌细胞的增殖和/或在受试者中诱导肿瘤 的缩小。
[0039] 本发明的另一个方面是用于防止和/或抑制由具有异常构象的P53而导致（例如 由……引起）的细胞增殖(例如癌细胞的增殖)的方法，所述方法包括将细胞与有效量的本 发明的抑制肽或CPP抑制剂或与包含本发明的抑制肽或CPP抑制剂的药物组合物接触。
[0040] 本发明的另一个方面是用于治疗患有与具有异常构象的P53相关(例如由……介 导的）的癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本发明的药物组 合物，从而抑制受试者中的癌细胞的增殖和/或缩小受试者中的肿瘤。
[0041] 本发明的另一个方面是用于治疗具有编码P53的突变基因，从而具有对发生癌症 (例如，李弗劳明综合征(Li-Fraumeni syndrome))的易感性的受试者的方法，所述方法包 括向受试者施用包含总共有效量的本发明的药物组合物的剂量(例如多个剂量，诸如通过 多次注射），从而减少或防止受试者中肿瘤的发展。
[0042]本发明的另一个方面是用于鉴定抑制p53的聚集的抑制肽的计算机实现的方法， 其包括以下步骤：
[0043] 鉴定包含p53区段TΠTLE(SEQIDN0:20)或LTΠTLE(SEQIDN0:21)的拉链形成 序列或来自靶多肽的拉链形成序列的镜像的模板肽序列，其中所述拉链形成序列聚集成立 体拉链；
[0044] 在计算机上设计至少一个与模板肽序列形成有利的空间和能量分子间相互作用 的互补肽序列，其中所述相互作用在立体拉链的上端或下端之一和两者上发生;和
[0045]鉴定选自由以下组成的组的候选抑制肽类化合物:互补序列、互补序列的镜像、互 补序列的肽模拟物和互补序列的镜像的肽模拟物。
[0046] 本发明的另一个方面是包含任选地包装在容器中的本发明的抑制肽或CPP抑制剂 的试剂盒。
[0047] 本发明的另一个方面是用于制备本发明的抑制肽的方法，所述方法包括以化学方 式合成所述抑制肽或以重组方式产生所述抑制肽。
[0048]如本文中的实施例中所述，基于p53的纤维形成区段的原子结构的测定，本发明人 已设计了一系列消除P53聚集的肽抑制剂。本发明人设计了为p53的正在生长的聚集体特异 性"加帽"的肽类抑制剂。
[0049] 通过使用ZipperDB算法(Goldschmidt等2010)，本发明人鉴定了可结晶的淀粉样 蛋白形成区段。本发明人通过化学方式合成p53252-258和p53253- 258区段，将它们结晶并通过微 结晶学测定它们的三维结构（图1)。所述结构显示典型的立体拉链结构，平行配准β链与β折 叠，它们以"面-对-背"(对于ρ53 252-258)和"面-对-面"（对于ρ53253-258)取向通过疏水侧链相 间交错（Sawaya等，Nature, 2007)。
[0050] 本发明人应用它们的基于Rosetta的方法（Sievers等，Nature，2011)，使用 p53252-258结构作为模板来设计破坏p53聚集的抑制剂。在本发明的其它实施方案中，将 P53253-258结构用作模板来设计抑制剂。
[0051 ]表1显示通过该方法获得的16个代表性抑制剂序列的列表。
[0052]表1.淀粉样蛋白p53聚集的设计的抑制剂(包括肽序列）的列表。INH-1R是第一设 计序列。合成与多聚精氨酸标签如细胞穿透肽(CPP)和来源于内源P53蛋白序列的短接头 (序列:RPI)融合的INH-1R和所有其它变体。抑制性设计的序列以粗体指示，而多聚粗氨酸 标签和接头以一般字体标示。
L〇〇54J 表1中的抑制剂序列是从表的第2栏的顶部全底部（SEQ ID N0:4全SEQ ID N0:17、 10和18)阅读。CPP抑制剂序列是从表的第3栏的顶部至底部（SEQ ID N0:22至SEQ ID NO: 35、28和36)阅读。
[0055] 相较于对其它蛋白质靶(不期望的靶)诸如显示一种或多种本文所述的p53介导 的功能的非聚集的或折叠的P53分子的结合，本发明的肽抑制剂特异性(选择性，优先)结合 具有异常构象(例如聚集为淀粉样蛋白纤丝或纤维，或部分或完全未折叠的或错误折叠的） 的P53。事实上，在本发明的肽抑制剂与非聚集的或折叠的p53分子之间未能检测到结合。
[0056] 其它合适的肽变体包括，例如，Leu-His-Arg-Ile-Tyr-Leu-Glu(SEQ ID N0:37)和 Leu-Tyr-Ile-Arg-Ile-Leu_Arg(SEQ ID N0:38)〇
[0057] 基于该结构分析，通过考虑表1中显示的16个序列，一个共有序列是[L，Y，E，W]T [R，K]，I T[L，Y]E(SEQ ID N0:1)。在另一个实施方案中，共有序列是[L，Y，E，W]TRIT[L， Y]E(SEQ ID勵:3)。残基#1、6和，在较低的程度上，#3与模板结构具有最少接触，并从而是 所述7个残基中的最可变的残基。
[0058]还包括上述序列的活性变体。这些变体是保留本文所述的抑制性多肽的性质（例 如，以构象依赖性、不依赖于序列的方式特异性结合聚集的P53的能力；抑制p53至p53或其 他蛋白质的原纤维形成的能力；例如在溶液中或在培养细胞中或在受试者中抑制细胞(包 括癌细胞)增殖的能力;诱导或起始细胞凋亡的能力;或缩小肿瘤细胞的能力）的变体。如本 文中所用，原纤维形成是指纤维或纤丝诸如淀粉样纤丝的形成。
[0059]合适的活性变体包括肽模拟化合物(含有能够模拟天然模拟肽的生物化学和/或 生物学作用的非肽结构元件，例如，被设计来模拟根据本文所述方法的肽的结构和/或结合 活性(诸如，例如，氢键和疏水堆积相互作用）的那些非肽结构元件的任何化合物）。本发明 的抑制肽或CPP抑制剂，包括其活性变体，在本文中有时被称为"肽类化合物"或"化合物"。
[0060] 在一个实施方案中，将抑制肽的活性变体在起始抑制肽的N末端、C末端或两端缩 短1-3个(例如，1、2或3个)氨基酸。在另一个实施方案中，将活性变体在起始抑制性多肽的C 末端延长(延伸）1、2、3或4个氨基酸。
[0061] 涵盖多种其它类型的活性变体。在一些实施方案中，取代共有序列中的除上文指 出的氨基酸外的氨基酸。这些氨基酸可帮助保护肽抑制剂免受蛋白水解或以其它方式稳定 肽，和/或以其它方式促成合意的药效学特性。在一些实施方案中，非天然氨基酸允许抑制 剂更紧密地结合靶，因为侧链优化与其的氢键合和/或非极性相互作用。另外，非天然氨基 酸提供引入可检测的标记物，诸如可用于例如测量值诸如抑制常数的强荧光标记物的机 会。此外，还包括肽模拟物，诸如，例如，类肽、β氨基酸、N-乙基化氨基酸和小分子模拟物。
[0062] 在一个实施方案中，将非天然氨基酸取代序列中的氨基酸。超过100种非天然氨基 酸是商购可得的。这些非天然氨基酸包括，例如，
[0063]可取代LEU的非天然氨基酸：
[0064]
[0065]可取代THR的非天然氨基酸：
[0066] Fmoc-Thr(tBu)-〇H 71989-35-0
[0067] Fmoc-(RS)-2-氨基-3-羟基-3-甲基丁酸 105504-72-1 [0068]可取代ILE的非天然氨基酸：
[0069] Fmoc-别-Ile-〇H 251316-98-0
[0070] Boc-N-Me-别-Ile-〇H 136092-80-3
[0071] Fmoc-高亮氨酸-OH 180414-94-2
[0072] 可取代GLU的非天然氨基酸：
[0073] Fmoc-γ -駿基_L_谷氛酸 111662-64-7
[0074] Fmoc-L-α-氨基辛二酸 218457-76-2
[0075]可取代ARG的非天然氨基酸：
[0076] Fmoc-Nco-硝基-L-精氨酸 58111_94_7
[0077] Fmoc-L-瓜氨酸 133174-15-9
[0078]可取代TYR的非天然氨基酸：
[0079]
[0080]
[0081]
[0082] 在另一个实施方案中，用D氨基酸取代一个或多个(例如1、2、3、4、5、6或7个凡_氨 基酸。
[0083] 在另一个实施方案中，将一个或多个(例如1、2、3、4、5、6或7)N_甲基化残基包含在 肽中。一些代表性的此类肽包括例如，
[0084] Leu-Thr-(Nme)Arg-Ile-Tyr-Leu-Glu(SEQ ID NO:39)
[0085] Leu-Thr-Arg-Ile-(Nme)Tyr-Leu-Glu(SEQ ID N0:40)
[0086] Leu-Thr-Arg-Ile-Tyr-(Nme)Leu-Glu(SEQ ID N0:41)
[0087] Leu-Thr-Arg-(Nme)Ile-Tyr-Leu-Glu(SEQ ID N0:42)
[0088] 本发明的抑制肽可包含例如，L-氨基酸、D-氨基酸、非天然氨基酸或其组合。
[0089]在一个实施方案中，所述抑制剂是已使用本文所述的p53的纤维形成区段之一的 原子结构作为用于设计抑制剂的基础，通过由Jiang等eLife 2013(其通过引用并入本文， 尤其是关于该方法)描述的方法设计的小分子。可通过Jiang等的该方法鉴定的合适的小分 子对于技术人员来说将是显而易见的。
[0090]在本发明的一个实施方案中，修饰本发明的肽以便1、2或3个其氨基酸被具有非天 然存在的侧链的氨基酸，诸如上述非天然氨酸，或被具有通过已由Jiang等eLife 2013设计 的小分子的交联(例如，通过Lys残基的ε氨基)修饰的侧链的氨基酸取代。下文中显示一些 代表性纤维结合分子。这些活性变体不仅为Ρ53的正在生长的聚集体加帽，而且还通过经修 饰的侧链结合(夹持)立体拉链的侧面，从而增强所述肽的抑制性活性。
[0091]由Jiang等eLife 2013设计的纤维结合化合物包括： 「00921
[0093] 为了增强本发明的抑制肽的细胞穿透性，可将它们与多种细胞穿透肽(CPP)中的 任一种融合。CPP通常具有含有相对高丰度的带正电荷的氨基酸诸如赖氨酸或精氨酸，或具 有含有极性/带电荷的氨基酸与非极性疏水氨基酸的交替模式的序列的氨基酸组成。这两 种类型的结构分别称为聚阳离子或两亲性结构。第三类CPP是疏水肽，只含有非极性残基， 具有低净电荷，或具有对于细胞吸收是至关重要的疏水性氨基酸基团。可与本发明的抑制 肽融合的一些典型的CPP提供于表2中。
[0094] ^2
[0095] ?名称序列
[0096] ?原始参考文献或综述
[0097] -polyARG nR where 4<n<17(e . g. ,n = 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15orl6) (SEQ ID N0:43)
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[0099] · polyLYS nK where 4〈K〈17(e.g.，K = 5,6,7,8,9，10，ll，12，13，14，15orl6) (SEQ ID N0:44)
[0100] · D-polyARG nR where 4〈n〈17(e.g.，n = 5,6,7,8,9，10，ll，12，13，14，15orl6)
[0101] · D-polyLYS nK where 4〈K〈17(e.g.，K = 5,6,7,8,9，10，ll，12，13，14，15orl6)
[0102] · SynBl RGGRLSYSRRRFSTSTGR(SEQ ID N0:45)
[0103] · SynB3 RRLSYSRRRF(SEQ ID N0:46)
[0104] · Penetratin RQIKIWFQNR疆KWKK(SEQ ID N0:47)
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