新型抗-Fc-γ受体IIB抗体及其用图
【专利说明】新型抗-Fc- γ受体I IB抗体及其用途
【背景技术】
[0001]作为蛋白质的免疫球蛋白基因超级家族的成员，Fey RII受体是由两个细胞外免 疫球蛋白结构域、一个单跨膜结构域和一个长度变化的胞浆结构域组成的单一多肽链 40kDa完整膜结合的糖蛋白。Fc γ RII受体在多种造血细胞上表达，是人血小板和巨核细胞 上的唯一Fc-受体（Cassel，McKenzie, 1993)。已知人的三种Fc γ RII受体，Fc γ RIIA、Fc γ RIIB和FcyRIIC，它们均结合IgG(例如以1-2X106M4的亲和性结合IgG〇或免疫复合物（IC， 例如IgG调理的病原体）dFc γ RIIA和Fc γ RIIB主要由于胞质结构域中的差异而互不相同， 所述差异最终导致受体连接后的功能性异质反应。Fc γ RIIA触发导致细胞的活化(例如吞 噬作用和呼吸爆发），而Fc γ RIIB起始抑制性信号，从而导致例如Β细胞活化的抑制。Fc γ RIIC与Fc γ RIIB共享胞外结构域，与Fc γ RIIA共享胞质结构域，从而在结合IgG或1C后传递 活化信号。Fc γ RIIB在除T细胞和NK细胞以外的所有白细胞上表达，是在人B细胞上表达的 唯一的抑制性Fc受体。单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞共表达 活化的Fc γ RIIA，而抑制性Fc γ RIIB受体和Fc γ RIIC在自然杀伤细胞(NK细胞)上表达并构 成该类细胞上的唯一 Fey R。已知Fey RIIB的两种在生物学功能不同的同种型。Fey RIIB-1 唯一地在B细胞上表达，而发现在1C结合后引起内吞-/吞噬作用诱导的Fc γ RIIB-2在所有 其他？。丫1?1113表达细胞上表达(附11111161'」&1111，1^￥61:。11，2008)。
[0002] ?〇丫1?118在胞外区中与？〇丫1?114享有93%的同源性。如上所述^〇丫1?118与卩〇丫 RIIA之间的主要差异存在于胞质结构域。Fc γ RIIB包含ΙΤΙΜ(基于免疫受体酪氨酸的抑制 基序），而Fc γ RIIA包含ΙΤΑΜ(基于免疫受体酪氨酸的活化基序）。
[0003] 通过1C结合的FcyRIIA簇集引起ΙΤΑΜ基序与引发ΙΤΑΜ基序(共有序列:￥12-171-X 8-Y-X2-L/I，Isakov，1997)中酪氨酸残基磷酸化的受体相关激酶的共定位以及随后与激酶 Syk相互作用，所述激酶Syk通过大量下游信号传导和基因活化事件来引发细胞的活化 (Ghazizadeh等，1994)。结合活性Fc γ RIIA的免疫球蛋白引起促炎性反应，该促炎性反应随 后导致病原体的去除，但在自身抗体的情况下，还可导致健康组织的破坏，从而达到病理性 自体免疫疾病峰。因此，需要对抗体特异性的严格控制和否定性反馈系统来避免免疫系统 对机体的异常破坏。所述抑制性Fc γ RIIB受体就是该否定性反馈系统的一部分。
[0004] Fc γ RIIB的特征在于在胞质结构域中存在Ι??Μ基序(共有序列:V/I-X-Y-X2-V/L， Isakov，1997)，其在Ig-聚集体或1C结合和与携带ΙΤΑΜ的活化Fc γ受体共连接后被激酶Lyn 磷酸化。经磷酸化的ITIM吸引多磷酸肌醇5'-磷酸酶的SH2-结构域(SHIP)，SHIP转而水解磷 酸肌醇信使，所述磷酸肌醇信使由于含ITAM的FeyR-介导的酪氨酸激酶活化而释放，因而 阻止细胞内Ca 2+的流入。Fc γ RIIB交联抑制对Fc γ R连接的活化反应，其继而抑制B细胞活 化、增殖和抗体分泌。
[0005] Fey RIIB具有两种抑制活性。如上所述，其一依赖于ΙΤΙΜ基序并在Fey RIIB连接 到携带ΙΤΑΜ的受体(例如Fey RIIA)时发生，导致ΙΤΑΜ触发的钙动员和细胞增殖的抑制。这 就意味着诸如脱粒作用、吞噬作用、ADCC、细胞因子释放和促炎活化的钙依赖性过程以及Β 细胞增殖都被Fc γ RIIB阻断。Fc γ RIIB的第二种抑制活性包括Β细胞上受体的同型聚集(Fc γ RIIB簇集）。同型聚集将促细胞凋亡信号递送到细胞质中，这可被Fc γ RIIB与B细胞受体 (BCR)的连接所阻断。多价-抗原结合后的BCR信号传导的特征在于簇集的BCR通过Lyn(Src 家族的一种激酶)磷酸化。这种Lyn作用下的磷酸化与BCR和被称作"脂筏"的富含鞘脂和胆 固醇的膜微结构域的联合一起发生。这些不溶的"脂筏"在免疫突触的形成中起着重要作 用。已观察到，BCR与APC(抗原提呈细胞)上的抗原的相互作用致使在所接合的B细胞和APC 的界面处形成该免疫突触。Fey RIIB与BCR的共连接使BCR与脂筏的联合去稳定，随后阻断B 细胞的免疫突触的形成。BCR信号传导的Fc γ RIIB抑制包含受体的细胞质结构域的ITIM中 的酪氨酸残基被激酶Lyn磷酸化以及随后的肌醇磷酸酶SHIP的募集(Daeron等.，1995， Ravetch and Bolland,2001)。
[0006] 科学界接受这样的观点：Fey RIIB可被看作外周B细胞发育过程中较晚检查点 (checkpoint)，并且其还直接调节浆细胞存活。因此Fey RIIB被认为是用于治疗B细胞障 碍、特别是B细胞介导的免疫反应的重要靶标。
[0007] 在小鼠和人中的研究已经阐明Fc γ RIIB对B细胞活性和体液耐受的影响，其中Fc yRIIB表达的降低或缺少造成了明显的自身免疫性疾病的发展或加剧。事实上，Fey RIIB 在诸如原发免疫性血小板减少症、全身性红斑狼疮、类风湿性关节炎(RA)、大疱性天疱疮、 寻常型天疱疮和其他天疱疮形式、B细胞驱动的多发性硬化症的自身免疫性疾病以及其他 以病原性免疫复合物发展为特征的自身免疫性疾病的发展和过程中起到关键作用。在健康 个体的免疫反应期间，已经进入血液循环的病原体受到针对病原体生物体的表位的抗体 (免疫球蛋白，Ig)的调理，并继而导致所谓的免疫复合物的形成。这些免疫复合物随后会被 免疫系统的特定细胞(如巨噬细胞、中性粒细胞、吞噬细胞)所吞噬，这导致病原体生物体从 血液循环中被清除。另外已经证明，Fc γ RIIB在外周耐受性方面也起着关键作用，因为Fc γ RIIB敲除小鼠发展自发的自身免疫性疾病。Fc γ RIIB不足导致对诱发的自身免疫性疾病的 易感性(Bolland和Ravetch，2000)。
[0008] 与健康人相比，在遭受自身免疫性疾病的患者中，Fc γ RIIB在B细胞上的表达通常 会减弱或降低。然而例如幼稚Β细胞显示出正常的Fc γ RIIB表达，来自RA患者的记忆Β细胞 和衆母细胞则显示出这一受体的表达降低(Catal;in，2010) Jiang及同事也能够表明，在来 自健康捐赠者的浆母细胞上通过表面耦合的抗-Fc γ RIIB抗体2.4G2的Fc γ RIIB交联导致 细胞凋亡(Xiang等，2007)
[0009] 基于上述的Fey RIIB在自身免疫性疾病中的显著作用，已经开发了针对该受体的 抗体，以便治疗或诊断患者。W0 2009/083009公开了针对Fc γ RIIB两种同种型的抗体，而TO 2004/016750公开了与内源表达于人细胞上的Fey RIIB的细胞外结构域特异性结合的抗 体，其亲和力是与表达于人细胞上的Fc γ RIIA结合的此类抗体的亲和力的至少10倍(记住 FcyRIIA和Fey RIIB的细胞外结构域享有高度同一性hEP 1 709 073公开了对Fey RIIB 具有高度特异性的抗体及其用于诊断和治疗自身免疫性疾病、感染病、肿瘤和其他异常病 症的用途。
[0010] 为了这样的目的，十分需要使用对该受体具有高特异性和亲和性的抗体。特别是 高特异性降低所述抗体交叉反应的风险，由此降低不利副作用，而高亲和性增强其应用的 效力和功效。同时也需要这样的抗体是非阻断性的，即它们通过其可变区与Fc受体的结合 不会干扰免疫复合物（1C)或聚集的IgG与细胞的结合。而且，针对Fey RIIB的抗体的一个非 常有利的优势在于:其影响Fc γ RIIB抑制耦合机制以控制B细胞活化。也就是说，已知Fc γ RIIB的细胞内部分包含所谓的Ι??Μ，并且通过携带Ι??Μ的受体的信号传导往往在免疫系统 的调节中是抑制性的。如上所述，已知Fc γ RIIB在被IgG分子的Fc部分结合时具有抑制性调 节功能。因此，需要利用Fey RIIB的抑制性调节功能，以期对包含在特别是自身免疫性疾病 中的B细胞进行控制。总而言之，尽管现有技术已经公开了若干具有不同特异性和亲和性的 抗Fc γ RIIB抗体，但仍然需要改善的抗Fc γ RIIB抗体用于治疗、预防和诊断受试者的自身 免疫性疾病。
[0011]通过提供本文下文描述的、在权利要求中进行表征且通过随附的实施例和附图进 行说明的抗体，本申请满足了这一需求。
[0012] 使本发明的发明人十分惊讶的是，他们观察到本发明所提供的抗体显著地增强了 ΙΤΙΜ的磷酸化。与现有技术中公开的也与Fc γ RIIB特异性结合的抗体相比，根据本发明所 述的抗体惊人地表现出意料之外的更强的对ΙΤΙΜ磷酸化的作用。这样更强的作用是有益 的。尤其是活化-抑制耦合，即阳性信号与抑制环的配对，控制许多生物过程的量级和持续 时间。在Β淋巴细胞中，克隆型Β细胞受体(BCR)对抗原的识别诱导能够指导克隆扩增、分化、 细胞因子释放并最终产生Ig的信号。活化刺激物的枯竭以及包含抑制性Fc γ受体(Fc γ R) 即Fey RIIb(CD32B)的负反馈环的触发防止不受控制的活化。后一种机制在BCR识别免疫复 合抗原时触发，从而导致通过复合结合的IgG的Fc结构域的CD32B共存接合，因而防止与被 可溶性IgG识别的那种享有相同特异性的B细胞克隆的扩增。因此，成功的负调节策略应形 成用于负信号传导环的分子基础。
【发明内容】
[0013] 本发明提供的抗体在CD32B的ΙΤΙΜ磷酸化方面表现出显著更强的作用，因而预期 它们对由CD32B的ΙΤΙΜ磷酸化触发的负信号传导环具有更强的影响，这继而控制特别是包 含在自身免疫性疾病中的Β细胞。
[00?4]特别地，与未经所述抗体处理的Daudi细胞相比，本发明的抗体优选地增强Daudi 细胞的？〇丫1?118的11']磷酸化。所述增强优选为1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。从与〇)328 结合的现有技术抗体，既无法预料也无法预见本发明所述的抗体的有利性质，更不必说成 功提供它们的合理预期，特别是本文所表征的CDR或可变重和/或轻链。除了本发明抗体这 一改善的性质，本文所述的抗体还对人Fc γ RIIB具有高特异性和/或是非阻断性的，即它们 通过其可变区与Fc受体的结合不会干扰免疫复合物(1C)或聚集的IgG与细胞的结合。
[0015]因此，本发明提供一种抗-Fc γ RIIB抗体，优选为IgG型的抗-Fc γ RIIB抗体，所述 抗体在其重链可变区中包含SEQIDN0s.29、30和31中所示的H-CDRl、H-CDR2和H-CDR3，并 且在其轻链可变区中包含SEQ ID NOs. 32、33和34中所示的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3。相比 于未经所述抗体处理的Daudi细胞，所述抗体使Daudi细胞的Fc γ RIIB的ITIM磷酸化增强约 4至10倍。
[0016] 从图7中明显可见，现有技术抗体GB3(见W0 2005/051999)和2B6(见W0 2004/ 016750)不能如本发明的抗体(诸如8A6,或者作为嵌合的或作为人源化的8A6抗体)那样增 强Fc γ RIIB的Ι??Μ磷酸化。故而能否增强Fc γ RIIB的Ι??Μ磷酸化似乎取决于CDR，特别是取 决于存在于8A6中而非GB3和/或2B6中的一些关键残基。因此，仅存在于8A6的⑶Rs中的处于 对应于2B6或GB3的CDR内各自位置的位置处的氨基酸可以被看作"关键残基"。
[0017] 对2B6、GB3和8A6中的CDR关键残基的视觉比较表明，本发明的抗体在H-CDR1中包 含SEQIDN0.29中所示的氨基酸序列，在H-CDR2中包含SEQIDN0.30中所示的氨基酸序 列，在H-CDR3中包含SEQIDN0.31中所示的氨基酸序列，在L-CDR1中包含SEQIDN0.32中 所示的氨基酸序列，在L-⑶R2中包含SEQ ID NO.33中所示的氨基酸序列，在L-⑶R3中包含 SEQ ID NO.34中所示的氨基酸序列。
[0018] 8A6、GB3和2B6的⑶R的氨基酸序列之间的差异还可以被表示为在使用8A6的⑶R作 为参考序列时在本发明的抗体的CDR中所允许的同一性程度（以同一性百分比表示）。因此， 本发明的抗体的H-⑶R1优选地表征为与SEQ ID N0.20中所示的H-⑶R1具有60%或更多（诸 如70%、80%或90% )同一性。
[0019] 本发明的抗体的H-CDR2优选地表征为与SEQ ID如.21中所示的!《^2具有36% 或更多(诸如 40%、50%、60%、70%、80% 或 90%)同一性。
[0020] 本发明的抗体的H-CDR3优选地表征为与SEQ ID ^).22中所示的!1-〇)1?具有50% 或更多（诸如60%、70%、80%或90% )同一性。
[0021] 本发明的抗体的L-CDR1优选地表征为与SEQ ID ^).23中所示的1^-〇?1具有64% 或更多（诸如70%、80%或90% )同一性。
[0022] 本发明的抗体的L-CDR2优选地表征为与SEQ ID ^).24中所示的1^-〇?2具有29% 或更多（诸如 30%、40%、50%、60%、70%、80% 或 90%)同一性。
[0023] 本发明的抗体的L-CDR3优选地表征为与SEQ ID ^).25中所示的1^-〇?3具有78% 或更多(诸如80 %或90 % )同一性。
[0024]因此，本发明提供一种抗-Fey RIIB抗体，所述抗体在其重链可变区中包含与SEQ IDN0.20中所示的H-CDR1序列具有60%或更多同一性的H-CDR1序列，与SEQIDN0.21中所 示的H-CDR2序列具有36%或更多同一性的H-CDR2序列，与SEQ ID勵.22中所示的!1-〇)1?序 列具有50%或更多同一性的H-CDR3序列，与SEQ ID勵.23中所示的1^-〇)1?1序列具有64%或 更多同一性的L-⑶R1序列，与SEQ ID N0.24中所示的L-⑶R2序列具有29%或更多同一性的 L-CDR2序列，和与SEQ ID如.25中所示的1^-〇)1?3序列具有78%或更多同一性的1^-〇)1?3序 列。
[0025] 优选地，所述抗体在其重链和轻链可变区⑶R中仍然包含如SEQ ID N0s.29、30、31 (Η-CDR)和SEQ ID从^.32、33、34〇^-〇)1〇中所定义的"关键残基"。
[0026] 优选地，相比于未经所述抗体处理的Daudi细胞，所述抗体使Daudi细胞的Fc γ RIIB的Ι??Μ磷酸化增强约4至10倍。
[0027] 本文所用术语"同一性百分比"是指在以如可得自www.clustal .org的ClustalW或 X技术或者等同技术所示例的最佳序列比对来比较两个氨基酸序列时，序列内相应位置处 的相同氨基酸残基的百分数。例如，在⑶R比对的情况下，SEQ ID NOs . 20-25中所示的每个 CDR(分别来自重链和轻链可变区）都分别作为重链或轻链可变区的目标CDR序列的参考序 列，例如SEQ ID N0.20的H-⑶R1与目标H-⑶R1比对。因此，比对两个序列（参考序列和目标 序列），两个序列之间相同的氨基酸残基被识别，然后将相同氨基酸的总数分别除以SEQ ID 勵.20、21、22、23、24或25氨基酸的总数(氨基酸长度），具体取决于是比对!1-〇)1?1、!1-〇)1?2、 !1-〇?3、1^-〇01?1、1^-〇?2还是1^-〇)1?3。相除的结果是一个百分比值，即同一性百分比值/程 度。
[0028] SEQ ID NOs.14和20中所示的H-CDR1序列是SEQ ID勵.29中所示的!1-〇)1?1的优选 序列种类。
[0029] SEQ ID N0s.l5和21中所示的H-CDR2序列是SEQ ID勵.30中所示的!1-〇)1?2的优选 序列种类。
[0030] SEQ ID NOs.16和22中所示的H-CDR3序列是SEQ ID N0.31中所示的H-CDR3的优选 序列种类。
[0031] SEQ ID NOs.17和23中所示的L-CDR1序列是SEQ ID勵.32中所示的1^-〇?1的优选 序列种类。
[0032] SEQ ID N0s.l8和24中所示的L-CDR2序列是SEQ ID勵.33中所示的1^-〇?1的优选 序列种类。
[0033] SEQ ID N0s.l9和25中所示的L-CDR3序列是SEQ ID勵.34中所示的1^-〇?3的优选 序列种类。
[0034]因此，本发明提供一种抗-Fc γ RIIB抗体，优选为IgG型的抗-Fc γ RIIB抗体，所述 抗体
[0035] (a)在其重链可变区中包含SEQ ID N0s.l4、15和16中所示的H-CDR1、H-CDR2和Η-CDR3,并且在其轻链可变区中包含SEQ ID N0s.l7、18和19中所示的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3;或者
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