体内测定
[0229] SLE-PBL-模型
[0230]以6Gy的剂量辐射Rag2/ γ -c/Fc γ -/-小鼠，并腹膜内注射不同量的500ylPBS中的 人外周血白细胞。
[0231]在人SLE-患者PBL移植到小鼠体内并由人免疫球蛋白Μ或G的存在而得到证实后， 对小鼠进行细胞注射后2周开始对小鼠的治疗。用200μ1缓冲液(PBS)或200μ1 PBS中的20yg 抗体(ch8A6_N297A)腹膜内注射对小鼠进行治疗，一周两次，治疗四周。每周进行一次称重 并取血以得到血清。在-80°C下冷冻血清样品至进一步使用（图12)。
[0232] ELISA
[0233] 通过ELISA分析血清样品中总体人IgG、IgM和抗-DNA IgM与IgG的存在。
[0234] 为了将血清样品中的总体血清IgM和IgG定量，根据制造厂商的说明使用Bethyl Human IgM ELISA Quantitation Kit和Human IgG ELISAQuantitation Kit(Biomol)〇用 VersaMax可调微量读板仪(Molecular Deivces)在450和650nm下测量OD。
[0235] 为检测抗-DNA抗体，在室温下用PBS中10ug/mL的甲基化BSA(Sigma)涂覆ELISA板2 小时。洗涤后，在4°C下用roS中50ug/mL的小牛胸腺DNA(Sigma)涂覆该板过夜。在室温下用 PBS/0.1%Gelatin/3%BSA/lmM EDTA封闭非特异性结合2小时。在所述封闭溶液中以1:100 稀释血清，在室温下孵育1小时。作为检测抗体，使用所述人IgM Quantitation Kit (Bethyl)的HRP-缀合的抗体，并在封闭溶液中以1:10000稀释，随后在室温下孵育1小时。 PBS用于所有的洗涤步骤。为进行检测，加入TMB溶液，用6%的正磷酸停止反应。
[0236] SLE PBL模型，总体人血清免疫球蛋白
[0237] 分析在移植了来自患有SLE的人捐赠者的PBL的小鼠体内总体人IgG水平[ug/mL]。 未检测到PBS或抗-Fey RIIB之间的总体人IgG的显著差异。根据本发明所述的抗体不会显 著影响总体人IgG(图13) ^
[0238] SLE PBL模型，对抗-DNA抗体的影响(疾病特异性IgG)
[0239] 在SLE-PBL转移/移植后第4周开始在抗-Fc γ RIIB小鼠体内观察到疾病特异性人 抗-DNA IgG的明显减少。本发明所述抗体特异性地减少了疾病相关抗-DNA抗体的量（图 14)〇
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【主权项】
1. 一种抗Fc γ RIIB抗体，所述抗体包含： (i) 与SEQ ID勵.20中所示的!1-〇)1?1序列具有60%或更多同一性的!1-〇)1?1序列， (ii) 与SEQ ID勵.21中所示的!1-〇)1?2序列具有36%或更多同一性的!1-〇)1?2序列， (iii) 与SEQ ID勵.22中所示的!1-〇)1?3序列具有50%或更多同一性的!1-〇)1?3序列， (iv) 与SEQ ID勵.23中所示的1^-〇)1?1序列具有64%或更多同一性的1^-〇)1?1序列， (v) 与SEQ ID勵.24中所示的1^-〇)1?2序列具有29%或更多同一性的1^-〇)1?2序列，和 (vi) 与SEQ ID勵.25中所示的1^-〇)1?3序列具有78%或更多同一性的1^-〇)1?3序列， 其中，相比于未经所述抗体处理的Daudi细胞，所述抗体使Daudi细胞的Fc γ RIIB的 Ι??Μ磷酸化增强约4至10倍。2. 根据权利要求1所述的抗体，所述抗体在其重链可变区中包含SEQ ID N0s.29、30和 31中所示的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3,并且在其轻链可变区中包含SEQ ID NOs.32、33和34 中所示的L-⑶Rl、L-⑶R2和L-⑶R3，其中与未经所述抗体处理的Daudi细胞相比，所述抗体 使Daudi细胞的Fc γ RIIB的Ι??Μ磷酸化增强约4至10倍。3. 根据前述权利要求中任一项所述的抗体，所述抗体 (a) 在其重链可变区中包含SEQ ID NOs.l4、15和16中所示的H-CDRUH-CDR2和H-CDR3， 并且在其轻链可变区中包含SEQ ID NOs.l7、18和19中所示的L-CDRUL-CDR2和L-CDR3;或 者 (b) 在其重链可变区中包含SEQ ID N0s.20、21和22中所示的H-CDRUH-CDR2和H-CDR3， 并且在其轻链可变区中包含SEQ ID NOs.23、24和25中所示的L-CDRUL-CDR2和L-CDR3， 其中与未经所述抗体处理的Daudi细胞相比，所述抗体使Daudi细胞的Fey RIIB的ITIM 磷酸化增强约4至10倍。4. 根据前述权利要求中任一项所述的抗体，所述抗体是嵌合的或人源化的。5. 根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO.3中 所示的氨基酸序列，并具有选自下述的突变中的至少一个:位置1处的氨基酸Q被E替代，位 置11处的氨基酸V被L替代，位置42处的氨基酸G被K替代，位置50处的氨基酸S被V替代，位置 53处的氨基酸Y被S替代，位置58处的氨基酸K被T替代，位置61处的氨基酸G被A替代，位置75 处的氨基酸S被T替代，位置76处的氨基酸K被R替代，位置77处的氨基酸N被S替代，和位置78 处的氨基酸T被N替代。6. 根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO.4中 所示的氨基酸序列，并具有选自下述的突变中的至少一个:位置1处的氨基酸Q被N替代，位 置28处的氨基酸S被N替代，位置31处的氨基酸S被T替代，位置33处的氨基酸V被L替代，位置 34处的氨基酸D被A替代，位置49处的氨基酸Y被F替代，位置53处的氨基酸T被N替代，位置55 处的氨基酸Y被A替代，位置89处的氨基酸L被Q替代，和位置93处的氨基酸N被Y替代。7. 根据前述权利要求中任一项所述的抗体，所述抗体包含SEQ ID NO. 1或3中所示的重 链可变区。8. 根据前述权利要求中任一项所述的抗体，所述抗体包含SEQ ID NO. 2或4中所示的轻 链可变区。9. 根据前述权利要求中任一项所述的抗体，所述抗体与根据SEQ ID NO.5的人Fey RIIB的氨基酸No. 20-40特异性结合。10. 根据前述权利要求中任一项所述的抗体，所述抗体在体外以具有至少4.9χ ΙΟ^Γ1 的解离速率常数的亲和性与人Fc γ Rllb结合。11. 根据前述权利要求中任一项所述的抗体，所述抗体在其重链恒定区中包含SEQ ID NO.6中所示的氨基酸序列。12. 根据前述权利要求中任一项所述的抗体，所述抗体在其轻链恒定区中包含SEQ ID NO.7中所示的氨基酸序列。13. -种抗-Fey RIIB抗体，所述抗体包含SEQ ID NO. 1或3中所示的重链可变区和/或 SEQ ID NO.2或4中所示的轻链可变区。14. 根据权利要求13所述的抗体，所述抗体在其轻链恒定区中包含SEQ ID NO.6中所示 的氨基酸序列。15. 根据权利要求13或14所述的抗体，所述抗体在其轻链恒定区中包含SEQ ID NO.7中 所示的氨基酸序列。16. -种编码权利要求1至15中任一项所述抗体的核酸序列。17. -种核酸载体，所述核酸载体包含插入载体分子的根据权利要求16所述的核酸序 列中的至少一种。18. -种用根据权利要求17所述的核酸载体转染的宿主细胞。19. 包含权利要求1至15中任一项所述的抗体作为活性成分的药物组合物。20. 权利要求1至15中任一项所述的抗体，所述抗体用于治疗或预防自身免疫疾病的方 法中，所述自身免疫疾病的特征在于产生自身抗体。21. 权利要求1至15中任一项所述的抗体，所述抗体用于治疗或预防免疫性血小板减少 症、全身性红斑狼疮、恶性贫血、艾迪生病、1型糖尿病、类风湿性关节炎、干燥综合征、皮肤 肌炎、多发性硬化症、重症肌无力、Reiter综合征、格氏病、寻常型和大疱性天疱疮、自身免 疫性肝炎、溃疡性结肠炎、冷凝集素病和自身免疫性周围神经病变的方法中。22. -种用于产生权利要求1至15中任一项所述的抗体的方法，所述方法包括在允许表 达被权利要求17所述的核酸载体包含的核酸序列的条件下培养权利要求18所述的宿主细 胞，并回收如此产生的抗体。
【专利摘要】本发明提供一种抗-FcγRIIB抗体，与现有技术抗体相比，其显著地增强了FcγRIIB的ITIM磷酸化并因此能够用于自身免疫性疾病的治疗或预防。
【IPC分类】C07K16/28, A61K39/395
【公开号】CN105636987
【申请号】CN201480057137
【发明人】P·松德尔曼, T·波尔, D·特米尔, A·卡尔, D·埃哈尔特, N·里特
【申请人】苏伯利莫尔公司
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2014年8月13日
【公告号】CA2921251A1, EP2837637A1, EP3033357A1, US20160185857, WO2015022076A1, WO2015022077A1, WO2015022077A8