[01化]4)用含有O.lwt%吐溫20(Tween-20)的PBS缓冲液轻轻润洗上述PVDF膜，将膜浸泡 在一抗CBH1多克隆抗体(该抗体是WCBH1的426-446肤段为抗原，由南京金斯瑞生物科技 有限公司合成）中，振荡，2~8°C保溫化。根据一抗进行稀释，可选用1:(5000~10000)稀释 度，抗体溶在50ml封闭液中，封闭液为含有3wt%牛血清白蛋白（BSA)和O.lwt%吐溫20 (Tween-20)的PBS缓冲液，一抗回收保存于0.02 %叠氮化钢中可重复使用十次W上。
[0106] 5)用含有O.lwt%吐溫20(Tween-20)的PBS缓冲液润洗上述PVDF膜，每次15min，重 复洗Ξ次。
[0107] 6)将上述PVDF膜浸泡在含有二抗(辣根过氧化物酶化RP)标记的羊抗兔二抗，购自 北京中山金桥生物技术有限公司）的解育液中，解育液为含有Iwt %牛血清白蛋白（BSA)和 0.1 wt %吐溫20(Tween-20)的PBS缓冲液，二抗由解育液稀释，稀释度为1:10000，室溫振荡 Iho
[010引7)再次用含有0.1 wt %吐溫20(Tween-20)的PBS缓冲液润洗膜，每次约15min，共洗 Ξ次。
[0109] 利用Millipore Western Blot化学发光HRP底物E化发光液(购自密理博(上海）贸 易有限公司）进行显色，Western Blot检测主要纤维素酶CB化结果如图5,其中黑色条带即 为显色后CB化。
[0110] 由上述结果可W看出，mnslp基因的敲除有效提升了外切纤维素酶1CBH1的分泌 量。2.3对步骤2.1中获得的发酵液蛋白浓度的检测方法参照化a壯ord法(Bra壯ord，1976) 进行。
[0111] W牛血清白蛋白（BSA)为标准蛋白获得蛋白浓度标准曲线。适当稀释的50μ1发酵 液加入20化1的考马斯亮蓝中，混合均匀，在595nm波长下读取吸光值。根据标准曲线，得出 蛋白质含量。
[0112] 由图6可W看出，mnslp敲除使瑞氏木霉TU6菌株的蛋白分泌能力提升50%左右。
[011引实施例3
[0114] Amnslp菌株发酵上清降解纤维素能力的检测
[0115] 3.1发酵上清降解微晶纤维素(Avicel)能力的检测
[0116] 1)对每一个EP管进行称重，并向每个EP管中称取0.05gA对CC階PH-101 (Sigma);
[0117] 2)加入步骤2.1中获得的发酵液，置于50°C摇床中震荡反应48h，1340化pm离屯、 Imin后取上清；
[0118] 3)将稀释不同倍数后的10化1上清与10化1 DNS相混合，100°C煮沸5min;
[0119] 4)最大转速离屯、5min，吸取上清18化1至96孔板中，OD550下检测其吸光值；
[0120] 5)根据已经做好的标准曲线，计算出还原糖的量;再次称重EP管，计算出Avicel的 损耗量。
[0121] 由图7和图8可见，mnslp的敲除使瑞氏木霉对微晶纤维素 (Avicel)的降解能力提 升了 20%-50%。
[0122] 3.2发酵上清外切纤维素酶酶活的研究
[0123] 吸取步骤2.1中获得的发酵液于130(K)rpm下离屯、lOmin，然后将上清分为两份，一 份100°C条件下煮沸lOmin作为灭活对照，一份不做任何处理。
[0124] 1)将2mM的对硝基苯-β-D纤维二糖巧（p-nitro地日11〇1-。日11〇13；[031(1日，9肥0溶于 50111]\1的齡(3-船4(3(抑4.8)的缓冲液中；
[0125] 2)加入0.1%(w/v)葡萄糖内醋抑制β-葡萄糖巧酶对纤维二糖侧链的水解；
[01%] 3)200μ1反应液中含适当稀释酶液50μ1，50mM HAc-化Ac缓冲液100μΙ，底物50μ1， 45°C，反应30min;
[0127] 4)加入10%化2(Χ)350μ1终止反应，420nm测定对硝基酪生成量。Κ?ΟμΜ对硝基酪加 同样比例的10%化2〇)3做标准曲线W计算纤维二糖产生量和酶活力单位。定义每分钟转化 InM底物为一个酶活力单位化)。
[012引由图9可见，mnslp的敲除使瑞氏木霉的外切纤维素酶的酶活提升了 80%-100%。
[0129] 3.3发酵上清内切纤维素酶酶活的研究
[0130] 1)吸取步骤2.1中获得的发酵液于130(K)rpm下离屯、lOmin，然后将上清分为两份， 一份100°C条件下煮沸lOmin作为灭活对照，一份不做任何处理。
[0131 ] 2)0.5% 的簇甲基纤维素钢（Carboxymethylcellulose 8〇(1;[加 1，〔10溶于5011^的 班巧酸钢缓冲液(pH 5.2)作为底物；
[0132] 3)50μ1发酵上清加入50μ1上述底物，50°C反应30min，同时加入灭活的发酵上清作 为对照；
[0133] 4)加入3,5-二硝基水杨酸（3,5-Dinitrosali巧licacid，DNS)100μl，煮沸10min 终止反应；
[0134] 5)0D55q条件下测定酶活。
[0135] 由图10可见，mnslp的敲除使瑞氏木霉的内切纤维素酶的酶活提升了 20%-50%。
[0136] 结论:与野生菌株相比，mnslp的敲除不仅提升了瑞氏木霉纤维素酶的分泌量、胞 外蛋白浓度而且明显提升了发酵液中外切纤维素酶和内切纤维素酶的活性，最终提升了发 酵液降解纤维素的能力。
【主权项】
1. 甘露糖苷酶I的表达基因在纤维素酶诱导表达中的应用。2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤如下： 敲除瑞氏木霉中的甘露糖苷酶I的表达基因，然后经诱导发酵，制得纤维素酶。3. 如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的瑞氏木霉购自美国典型微生物菌种保 藏中心，菌种保藏号为:ATCC MYA-256。4. 如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述甘露糖苷酶I的表达基因核苷酸序列如 SEQ ID NO.2所示，甘露糖苷酶I的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。5. 如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的纤维素酶为外切纤维素酶CBH1、外切 纤维素酶CBH2、内切纤维素酶EG1、内切纤维素酶EG2、内切纤维素酶EG3、内切纤维素酶EG4 和/或内切纤维素酶EG5。6. 如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述敲除瑞氏木霉中的甘露糖苷酶I的表达 基因，步骤如下： (1) 以瑞氏木霉TU6的基因组为模板，以特异引物mnslp up F和mnslp up R进行PCR扩 增，制得上游同源臂； 特异引物核苷酸序列如下：PCR反应条件如下： 95°C预变性10min;95°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸1~2min，反应30个循环；72°C 延伸lOmin; PCR反应体系如下：(2) 以瑞氏木霉的基因组为模板，以特异引物mnslp down F和mnslp down R进行PCR扩 增，制得下游同源臂； 特异引物核苷酸序列如下：PCR反应条件如下： 95°C预变性10min;95°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸1~2min，反应30个循环；72°C 延伸lOmin; PCR反应体系如下：(3) 将步骤（1)制得的上游同源臂与步骤(2)制得的下游同源臂采用BP colne反应试剂 盒连入具有pyrG筛选标记的pD0NR?221载体中，筛选具有上下游同源臂的质粒，制得含有Δ mnslp :: pyrG敲除盒的质粒； (4) 将步骤(3)制得的含有Amnslp :: pyrG敲除盒的质粒用I-Scel酶切线性化后，凝胶 回收，以尿苷营养缺陷型瑞氏木霉TU6为出发菌株进行原生质体转化，挑取在无尿苷的MM平 板上可以生长的转化子，即得。7. 如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述步骤(4)中瑞氏木霉TU6购自美国典型微 生物菌种保藏中心，菌种保藏号为:ATCC MYA-256。8. 如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的诱导发酵，条件如下： 在瑞氏木霉预培养培养基中接种瑞氏木霉的孢子1〇6个，30 °C，200转/分钟培养36小时， 用G1砂芯漏斗收集菌丝并转移到新鲜的瑞氏木霉预培养培养基中继续培养12小时，最后将 菌丝收集并以24g/L的接种量转接至诱导培养基中，30°C，200转/分钟继续培养，每隔12小 时取发酵液，进行纤维素酶表达的检测。9. 如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述预培养培养基，每升组分如下： (NH4)2S〇4 1.4g、K2HP〇4 2.0g、Na2HP〇4.12H2〇 17.907g、尿素0.3g、吐温800.5ml、MgS〇4 0.6g、CaCl2 0.6g、FeS〇4*7H20 5.0mg、MnS〇4.H20 1.6mg、ZnS〇4 1.4mg、CoCl2 2.0mg、尿苷 2 · 44g、甘油10ml、蛋白胨lg，朽1檬酸调pH至5 · 0。10. 如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述诱导培养基，每升组分如下： (NH4)2S〇4 1.4g、K2HP〇4 2.0g、Na2HP〇4.12H2〇 17.907g、尿素0.3g、吐温800.5ml、MgS〇4 0.6g、CaCl2 0.6g、FeS〇4*7H20 5.0mg、MnS〇4.H20 1.6mg、ZnS〇4 1.4mg、CoCl2 2.0mg、尿苷 2.44g、微晶纤维素10g，朽1檬酸调pH至5.0。
【专利摘要】本发明涉及甘露糖苷酶I的表达基因的应用。所述应用，步骤如下：敲除瑞氏木霉中的甘露糖苷酶I的表达基因，然后经诱导发酵，制得纤维素酶。本发明构建的微生物在同等条件下能提升纤维素酶的产量及催化降解纤维素的活性，对于促进纤维素酶工业生产，实现木质纤维素类物质合理利用，解决日益临近的能源与环境危机问题，实现可持续发展具有极其重大的意义，因此具有广阔的应用前景。
【IPC分类】C12N9/42, C12R1/885, C12N15/80
【公开号】CN105671021
【申请号】CN201610117952
【发明人】齐飞飞, 刘巍峰, 马爽, 张伟欣, 陈冠军
【申请人】山东大学
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年3月1日