菊花对称性基因CmCYC2c及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及植物基因，具体地说，设及菊花对称性基因 CmCYC2c及其在调控菊花舌 状花花瓣性状中的应用。
【背景技术】
[0002] 被子植物的花有福射对称和左右对称两种形式，其中两侧对称的花是由福射对称 的花演变而来。两侧对称花的进化不仅丰富了花部的形态，也因提高了传粉效率从而促进 了物种的生存能力化ndress，1998)。菊花(Chrysanthemum morifOIium)为头状花序，每个 花序由许多小花构成，其中舌状花为雌花，属于左右对称；中央管状花为两性花，属于福射 对称。菊花舌状花和管状花的构成和分布差异形成了千姿百态的品种类型。近年来，随着基 因工程技术的迅速发展，通过遗传转化的技术在植物体内过量表达特定的内源基因 W调控 观赏植物的花部形态已成为现代育种的重要手段。对模式植物金鱼草（Antirrhinum ma化S)的研究掲示了 CYC2基因（TCP基因家族)对花对称性的调控作用，研究表明cyc/di Ch 双突变体的花由两侧对称变成了福射对称，花的背部、侧部和腹部属性的差异消失，每个花 瓣都成为两侧对称而且所有的花瓣都腹部化，花瓣数目比野生型多一个，即由5个变成6个 化UO et al.，1996; 1999)。而在菊科的头状花序中，CYC2类基因对花朵对称性的影响方式 具有新的特点。在非洲菊(Gerbera hybrida)中，化CYC2基因的表达减缓了营养生长并抑制 其向生殖生长的转变，导致部分不能正常开花;另外对花序的改变包括舌状花瓣的变短，管 状花瓣的延长和雄蕊的崎形，增强了管状花的两侧对称性，从而影响了其头状花序形态 (Qiapman et al. JOOSihhtihadu et al. ,2012)。而在向日葵（Helianthus annuus)中， 转座子在化CYC2C不同位置的插入导致该基因的过表达或被沉默，结果使过表达植株的中 屯、花盘出现更多舌状花，而被沉默植株的舌状花的形成受影响（畑apman et al ,2012; Fambrini et al. ,2014)。野生菊花均具有良好的生态适应性和抗逆性，比如菊属模式植物 二倍体甘菊(化rysanthemum Iavandulifolium)广布于中国大江南北的各种生态环境中。 但目前二倍体种均为单轮舌状花，运极大限制了其在生态园林中的观赏应用及新品种培 育。如果能通过基因工程的技术引入重瓣基因逐步改善其舌状花瓣型，将极大促进其在生 产中的应用。目前菊花CYC2类基因的功能研究尚未见报道，而通过利用其改善菊花花型的 技术更是缺乏。另外菊花花型新品种培育的主要方法依然是传统的杂交育种，相对于分子 育种，其不仅周期长且难W实现定向培育。
【发明内容】
[0003] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供菊花对称性基因 CmCYC2c 及其在调控菊花舌状花花瓣性状中的应用。
[0004] 为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
[0005] 第一方面，本发明提供了一种菊花对称性基因 CmCYC2c，其核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0006] 第二方面，本发明提供了前述基因在调控菊花舌状花花瓣性状中的应用，所述菊 花舌状花花瓣性状具体表现为舌状花花瓣数目或花瓣长度。
[0007] 更为具体地，所述菊花对称性基因 CmCYC2c在菊花中的表达可使菊花舌状花花瓣 数目增加和/或花瓣长度增长。
[0008] 进一步地，本发明还提供了前述基因在培育地被菊花型新品种中的应用，具体为 将SEQ ID NO. 1所示的基因序列构建到植物表达载体PCAMBIA1304质粒中，筛选阳性质粒， 通过农杆菌介导将阳性质粒转化入菊花叶盘，获得转基因菊花，筛选阳性转基因株系。所述 阳性转基因株系经正常培育可得到改良花型的甘菊，其舌状花数目增多，花瓣长度增长，为 利用基因工程技术初步选育菊花花型新品种提供了新颖实用的方法。
[0009] 更进一步地，培育地被菊花型新品种设及构建转基因菊花的步骤。本发明针对甘 菊提供一个具体的实施方式，转基因甘菊的构建主要包括如下步骤：
[0010] 1)植物表达载体 pCAMBIA1304-CmCYC2c 的构建：
[0011] W沈Q ID NO. 1所示的菊花CmCYC2c基因序列为模板，利用沈Q ID NO.8和SEQ ID ^.9所示的引物(〇11〔￥〔2(3斗2和〇11〔￥〔2(3-1?2)经高保真酶进行口0?扩增，扩增产物经回收后 用In-Fusion HD Cloning Kit法连接至经NcoI单酶切线性化的质粒载体PCAMBIA1304上， 连接产物经转化涂板后，分别在化MV35S和GFP上设计一对特异引物35S-F1和GFP-Rl (序列 如SEQ ID NO. 10和SEQ ID NO. 11所示)对阳性克隆进行筛选，测序序列正确的菌落经扩大 培养后，提取阳性质粒pCAMBIA1304-CmCYC2c。
[0012] 2)农杆菌介导的叶盘法转化甘菊：
[0013] 将步骤1)所得的阳性质粒转化农杆菌(菌株EHA105)感受态细胞，利用农杆菌侵染 法侵染甘菊叶盘，获得转CmCYC2c基因甘菊。
[0014] 3)筛选阳性转基因株系：
[0015] 采用PCR法对转基因株系进行验证。提取抗潮霉素植株叶片基因组DNA，在CaMV35S 启动子上设计上游引物35S-F2，序列如SEQ ID NO. 12所示，在CmCYC2c序列上设计下游引物 CmCYC2c-R3,序列如SEQ ID NO. 13所示。W未转化植株为阴性对照，对转基因再生株系进行 初步PCR检测，选取初步检测为阳性株系的花序提取RNA并反转录为cDNA，然后采用巧光定 量RT-PCR计算各株系CmCYC2c的相对表达情况。W化ACTIN为内参设计一对引物ClACT-Fl和 ClACT-Rl，序列如沈Q ID NO. 14和沈Q ID NO. 15所示，再设计一对CmCYC2c-0RF区的特异引 物〇1￡￥〔2。斗4和〇1￡￥〔2。-1?4，沈9 10側.16和沈9 10側.17所示，对〇11〔￥〔2。在不同株系花 序中的表达量进行验证。经过PCR和巧光定量RT-PCR检测为阳性的为转基因阳性株系。
[0016] 其中，质粒载体PCAMBIA1304为市售可得载体，如可购自生物风生物技术服务公 司。CnACTIN为已知基因，NCBI登录号为KF305683.1。
[0017] 本发明仅W甘菊为例，提供了具体的实施方式，但所述基因在菊花中的应用并不 局限于甘菊品种。
[001引第=方面，本发明提供了含有前述基因的载体及工程菌。
[0019]作为优选，所述载体W含有潮霉素抗性基因、CaMV35S启动子和GFP元件的 PCAMBIA1304质粒为骨架，并通过酶切方式连接有前述基因序列。该载体由于含有潮霉素抗 性基因、CaMV35S启动子和GFP元件，能够更好地在后期通过潮霉素筛选生根植株，并利于从 分子水平上进行检测。
[0020] 本发明的有益效果在于：
[0021] 本发明发现了菊花对称性基因 CmCYC2c在改善菊花舌状花瓣型，尤其是增加舌状 花花瓣数目和增长花瓣长度方面的新应用。进而提供了采用转基因技术，将CmCYC2c基因整 合到甘菊基因组中，初步定向改良花型，使其舌状花数目增多，花瓣长度增长，为利用基因 工程技术初步选育菊花花型新品种提供了新颖实用的方法。
[0022] 本发明所述的植物表达载体中，引入了潮霉素抗性基因、CaMV35S启动子和GFP，利 于后期通过潮霉素筛选生根植株，利于从分子水平上进行检测，二者结合准确可靠。
【附图说明】
[0023] 图1为本发明所述的植物表达载体pCAMBIAl 304-CmCYC2c的载体图谱。
[0024] 图2为本发明实施例1中CmCYC2c载体构建电泳图，其中，M:Mark2000 ; 1: CmCYC2c 3 ' RACE 扩增；2: CmCYC2c 第一轮 5 ' RACE; 3: CmCYC2c 第二轮 5 ' RACE 末端序列扩增；4: CmCYC2c 基因的ORF序列扩增;5 :pCAMBIA1304-CmCYC2c