一种枯草芽孢杆菌发酵生产启动子及其应用方法
一种枯草芽孢杆菌发酵生产启动子及其应用方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物基因工程领域，具体设及一种枯草芽抱杆菌发酵生产启动子及 其应用方法。
【背景技术】
[0002] 启动子为RNA聚合酶特异性识别和结合的DNA序列。启动子是基因（gene)的一个组 成部分，控制基因表达(转录）的起始时间和表达的程度。启动子(Promoters)就像"开关"， 决定基因的活动。既然基因是成序列的核巧酸(nucleotides )，那么启动子也应由核巧酸组 成。启动子本身并不控制基因活动，而是通过与称为转录(transcription)因子的运种蛋白 质（proteins)结合而控制基因活动的。转录因子就像一面"旗子"，指挥着酶(enzymes )(RNA 聚合酶polymerases)的活动。运种酶指导着RNA复制。
[0003] 启动子位于结构基因5'端上游的一段DNA序列，能够指导全酶化oloenzyme)同模 板正确结合，活化RNA聚合酶，启动基因转录。全酶是指酶蛋白及其辅酶构成的有功能的复 合物。
[0004] 随着生物工程技术的发展，越来越多的微生物发酵的方法应用于化学品、酶蛋白 W及药剂的生产。其中，枯草芽抱杆菌由于其安全无毒、遗传背景清晰、分泌表达水平高等 诸多优点，而成为工业用理想的宿主细胞。枯草芽抱杆菌中表达异源蛋白需要各种元件，其 中，启动子对于表达水平的影响至关重要。目前成功用于枯草芽抱杆菌表达平台的启动子 主要有?43、口曰11179、口3口曰(3、口巧14等，运些启动子在实验室的富集培养基中表现良好，但鲜见 它们被用于酶蛋白的工业放大生产。因此，有必要找到更高效的、适合于工业培养基生产表 达的启动子，W适应发酵对表达水平越来越高的要求。
[0005] 绿色巧光蛋白基因gfp可W作为启动子的一个报告基因，构建于启动子的下游，绿 色巧光蛋白GFP的有无，表征启动子的作用；绿色巧光蛋白GFP的亮度，即绿色巧光蛋白GFP 的产量，在同等条件下表征启动子的强弱。在启动子筛选或启动子功能比较中，可W用GFP 的表达水平作为鉴定的标准。
【发明内容】
[0006] 为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种枯草芽抱杆菌发 酵生产启动子及其应用方法。
[0007] 为了实现上述目的W及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：
[000引本发明的第一方面提供了一种分离的多核巧酸，所述多核巧酸的碱基序列含有如 沈Q ID NO. 1所示序列。
[0009] 优选地，所述分离的多核巧酸序列的碱基序列如SEQ ID NO. 1所示，具体为：
[0010] Ctctcactaaatagcaagtcatatctgtccgtccttccttttttccgccaagtgctgtttcagctgcattctcgccc tgtacagggtgctcttcaccttcgaaagactccagtccaaaacatcagcaatctcttcgtaagacagctcttgaaat atctgtcgaaatgctgaataaaatgactgaaaatctctgacatctgaaacaatccttttcgtttattaaggcctcac ccgtttagacaaacggctataaaaaaagttttacaaatcggaacatttttcccctatcatttttcccgacttcattt gtcatttttttcagaataaatcgcatcattcgactcatgtctgattcaacacgtgcctctcggcttataccccgatg ctggccgccgg过过gcctttccggg过Cg过ttct过tc过过ttc过tc过gcgg过gtct过gtttt过t过ttgc过g过过tg过g过g过 atgctggtttattataacaatataagttttcattattttcaaaaagggggatttatto
[0011] 本发明的第二方面提供了前述分离的多核巧酸作为启动子的用途，所述启动子用 于多种蛋白或多肤的表达。
[0012] 优选地，所述启动子用于微生物反应器中多种蛋白或多肤的表达。
[0013] 具体的，所述微生物反应器可W为微生物宿主细胞。
[0014] 更具体的，所述启动子可用于在微生物宿主细胞中指导多种不同来源的蛋白或多 肤的诱导表达。
[0015] 优选地，所述微生物宿主细胞包括但不限于枯草芽抱杆菌。
[0016] 进一步的，所述的多种不同来源的蛋白或多肤可W是任意分子量的蛋白质，如酶 蛋白、各种植物来源蛋白、各种动物或细菌来源蛋白，W及抗体等。
[0017] 本发明的第=方面提供了一种启动子，所述启动子的碱基序列中含有如SEQ ID NO. 1所示的分离的多核巧酸序列。
[0018] 优选地，所述启动子的碱基序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0019] 本发明的第四方面提供了所述启动子用于构建或改造表达载体的用途。
[0020] 优选地，所述启动子用于构建或改造微生物反应器表达载体。
[0021] 进一步优选地，所述的启动子可作为指导外源蛋白表达的元件用于构建或改造微 生物反应器表达载体。
[0022] 所述待改造微生物生物反应器表达载体包括但不限于枯草芽抱杆菌表达载体。所 述枯草芽抱杆菌表达载体包括但不限于pM4系列载体等。
[0023] 本发明的第五方面提供了一种表达载体，所述表达载体含有至少一个所述的启动 子，由所述的启动子来指导外源蛋白的表达。具体如绿色巧光蛋白GFP。
[0024] 优选地，所述表达载体为将现有表达载体中的启动子替换为本发明的前述启动 子，或者在现有表达载体中添加本发明的前述启动子后获得。
[0025] 本发明的一优选实施例中，在现有表达载体pMK4中添加了本发明所述的启动子后 获得了新的表达载体。
[0026] 更优选地，所述表达载体上的启动子的下游连接有GFP基因。
[0027] 本发明的第六方面提供一种宿主细胞，所述细胞含有前述表达载体或基因组中整 合有外源的所述启动子。
[0028] 本发明的第屯方面提供了一种蛋白或多肤的表达方法，包括下列步骤：
[0029] 1)采用前述表达载体构建所述多种不同来源的蛋白或多肤的重组表达载体；
[0030] 2)将步骤1)获得的重组表达载体转染宿主，并在合适表达所述蛋白或多肤的条件 下培养所述宿主。
[0031] 优选地，所述宿主可W为宿主细胞，在本发明一实施例中，所述宿主为枯草芽抱杆 园。
[0032] 优选地，所述在合适表达所述蛋白或多版的条件下具体为采用工业生产培养基 PPB诱导。
[0033] 优选的，所述步骤2)后，可从培养物中分离出所述蛋白或多肤，或者通过检测仪器 检测所述多种不同来源的蛋白或多肤。在本发明一实施例中，所述蛋白或多肤为GFP。
[0034] 通过常规的重组DNA技术即可构建所述多种不同来源的蛋白质或多肤的重组表达 载体，例如将目的基因片段插入所述表达载体的多克隆位点，并置于本发明所述启动子的 控制之下。所述目的基因片段应当至少包含多种不同来源的蛋白质或多肤的基因的完整编 码区。
[0035] 获得的转有重组表达载体的宿主细胞可W用常规方法培养，表达外源蛋白质或多 肤。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自已知的各种合适的培养基或培养液， 在适于宿主细胞生长的条件下进行培养并表达外源蛋白质或多肤。如果需要，可利用其物 理的、化学的和其它特性或添加纯化标签通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。运些 方法是本领域技术人员所熟知的。运些方法的例子包括但并不限于：用蛋白沉淀剂处理(盐 析方法）、离屯、、渗透破壁、超处理、超离屯、、分子筛层析(凝胶过滤）、吸附层析、离子交换层 析、高效液相层析化PLC)和其它各种液相层析技术及运些方法的结合。
[0036] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0037] 本发明的发明人，将前述启动子与GFP连接，转化枯草芽抱杆菌，检测启动子对外 源基因（或蛋白）表达的影响。通过检测GFP的表达结果证明，该启动子具有启动子的活性， 并受工业生产培养基PPB诱导活性增强。此外，本发明启动子与其他启动子进行比较，所诱 导表达的GFP量比其他启动子高65%~114%，外源蛋白或多肤在微生物的重组生产，并具 有受诱导可调控的活性特征。
【附图说明】
[0038] 图1是克隆了启动子P1398的表达质粒pMK4-P1398-g巧图。
[0039] 图 2 是质粒pMK4-奸P、PMK4-P1398-gf P、PMK4-P43-奸P、pMK4-Pxy 1 A-gf P 的构建流 程图。
[0040] 图 3 是克隆了 启动子P1398、P43、PxyiA 的表达质粒pMK4-P1398-gfp、pMK4-P43-奸P、 pMK4-PxylA-gfp在枯草芽抱杆菌中，在蛋白酶生产培养基培养条件下发酵后表达的巧光量 图。
【具体实施方式】
[0041] 在进一步描述本发明【具体实施方式】之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下 述特定的具体实施方案;还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体 实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法， 通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
[0042] 当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端 点W及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和 科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、 材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可W使用与本 发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实 现本发明。
[0043] 除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领 域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及 相关领域的常规技术。运些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等 MOLECULAR CL0NING:A LABORATORY MANUAL,Second edition,Cold Spring Harbor LaboratoiT Press,1989 and Third edition，2001;Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BI0L0GY，John Wiley&Sons,New York,1987 and periodic updates;the series METHODS IN ENZYMOLOGY,Academic Press,San Diego；Wolffe,CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTIONJMrd edition ,Academic Press, San Diego ,1998 !METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，畑romatin。.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.),Academic Press，San Diego,1999;和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY'Vol.119,Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press,Totowa，1999等。
[0044] 实施例1构建质粒PMK4-P1398-奸p、pMK4-P43-奸p、pMK4-P巧lA-gfp并在枯草芽抱 杆菌中表达绿色巧光蛋白GFP
[0045] 1. DNA片段的扩增
[0046] W2409-PstF(沈Q ID N0.2)和2409NdeR(SEQ ID ^.3)为引物，^1398基因组为 模板，扩增P1398;WP43-PstF(SEQ ID N0.4)和P43-XmaR(沈Q ID ^.5)引物，^9]\
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物基因工程领域，具体设及一种枯草芽抱杆菌发酵生产启动子及 其应用方法。
【背景技术】
[0002] 启动子为RNA聚合酶特异性识别和结合的DNA序列。启动子是基因（gene)的一个组 成部分，控制基因表达(转录）的起始时间和表达的程度。启动子(Promoters)就像"开关"， 决定基因的活动。既然基因是成序列的核巧酸(nucleotides )，那么启动子也应由核巧酸组 成。启动子本身并不控制基因活动，而是通过与称为转录(transcription)因子的运种蛋白 质（proteins)结合而控制基因活动的。转录因子就像一面"旗子"，指挥着酶(enzymes )(RNA 聚合酶polymerases)的活动。运种酶指导着RNA复制。
[0003] 启动子位于结构基因5'端上游的一段DNA序列，能够指导全酶化oloenzyme)同模 板正确结合，活化RNA聚合酶，启动基因转录。全酶是指酶蛋白及其辅酶构成的有功能的复 合物。
[0004] 随着生物工程技术的发展，越来越多的微生物发酵的方法应用于化学品、酶蛋白 W及药剂的生产。其中，枯草芽抱杆菌由于其安全无毒、遗传背景清晰、分泌表达水平高等 诸多优点，而成为工业用理想的宿主细胞。枯草芽抱杆菌中表达异源蛋白需要各种元件，其 中，启动子对于表达水平的影响至关重要。目前成功用于枯草芽抱杆菌表达平台的启动子 主要有?43、口曰11179、口3口曰(3、口巧14等，运些启动子在实验室的富集培养基中表现良好，但鲜见 它们被用于酶蛋白的工业放大生产。因此，有必要找到更高效的、适合于工业培养基生产表 达的启动子，W适应发酵对表达水平越来越高的要求。
[0005] 绿色巧光蛋白基因gfp可W作为启动子的一个报告基因，构建于启动子的下游，绿 色巧光蛋白GFP的有无，表征启动子的作用；绿色巧光蛋白GFP的亮度，即绿色巧光蛋白GFP 的产量，在同等条件下表征启动子的强弱。在启动子筛选或启动子功能比较中，可W用GFP 的表达水平作为鉴定的标准。
【发明内容】
[0006] 为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种枯草芽抱杆菌发 酵生产启动子及其应用方法。
[0007] 为了实现上述目的W及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：
[000引本发明的第一方面提供了一种分离的多核巧酸，所述多核巧酸的碱基序列含有如 沈Q ID NO. 1所示序列。
[0009] 优选地，所述分离的多核巧酸序列的碱基序列如SEQ ID NO. 1所示，具体为：
[0010] Ctctcactaaatagcaagtcatatctgtccgtccttccttttttccgccaagtgctgtttcagctgcattctcgccc tgtacagggtgctcttcaccttcgaaagactccagtccaaaacatcagcaatctcttcgtaagacagctcttgaaat atctgtcgaaatgctgaataaaatgactgaaaatctctgacatctgaaacaatccttttcgtttattaaggcctcac ccgtttagacaaacggctataaaaaaagttttacaaatcggaacatttttcccctatcatttttcccgacttcattt gtcatttttttcagaataaatcgcatcattcgactcatgtctgattcaacacgtgcctctcggcttataccccgatg ctggccgccgg过过gcctttccggg过Cg过ttct过tc过过ttc过tc过gcgg过gtct过gtttt过t过ttgc过g过过tg过g过g过 atgctggtttattataacaatataagttttcattattttcaaaaagggggatttatto
[0011] 本发明的第二方面提供了前述分离的多核巧酸作为启动子的用途，所述启动子用 于多种蛋白或多肤的表达。
[0012] 优选地，所述启动子用于微生物反应器中多种蛋白或多肤的表达。
[0013] 具体的，所述微生物反应器可W为微生物宿主细胞。
[0014] 更具体的，所述启动子可用于在微生物宿主细胞中指导多种不同来源的蛋白或多 肤的诱导表达。
[0015] 优选地，所述微生物宿主细胞包括但不限于枯草芽抱杆菌。
[0016] 进一步的，所述的多种不同来源的蛋白或多肤可W是任意分子量的蛋白质，如酶 蛋白、各种植物来源蛋白、各种动物或细菌来源蛋白，W及抗体等。
[0017] 本发明的第=方面提供了一种启动子，所述启动子的碱基序列中含有如SEQ ID NO. 1所示的分离的多核巧酸序列。
[0018] 优选地，所述启动子的碱基序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0019] 本发明的第四方面提供了所述启动子用于构建或改造表达载体的用途。
[0020] 优选地，所述启动子用于构建或改造微生物反应器表达载体。
[0021] 进一步优选地，所述的启动子可作为指导外源蛋白表达的元件用于构建或改造微 生物反应器表达载体。
[0022] 所述待改造微生物生物反应器表达载体包括但不限于枯草芽抱杆菌表达载体。所 述枯草芽抱杆菌表达载体包括但不限于pM4系列载体等。
[0023] 本发明的第五方面提供了一种表达载体，所述表达载体含有至少一个所述的启动 子，由所述的启动子来指导外源蛋白的表达。具体如绿色巧光蛋白GFP。
[0024] 优选地，所述表达载体为将现有表达载体中的启动子替换为本发明的前述启动 子，或者在现有表达载体中添加本发明的前述启动子后获得。
[0025] 本发明的一优选实施例中，在现有表达载体pMK4中添加了本发明所述的启动子后 获得了新的表达载体。
[0026] 更优选地，所述表达载体上的启动子的下游连接有GFP基因。
[0027] 本发明的第六方面提供一种宿主细胞，所述细胞含有前述表达载体或基因组中整 合有外源的所述启动子。
[0028] 本发明的第屯方面提供了一种蛋白或多肤的表达方法，包括下列步骤：
[0029] 1)采用前述表达载体构建所述多种不同来源的蛋白或多肤的重组表达载体；
[0030] 2)将步骤1)获得的重组表达载体转染宿主，并在合适表达所述蛋白或多肤的条件 下培养所述宿主。
[0031] 优选地，所述宿主可W为宿主细胞，在本发明一实施例中，所述宿主为枯草芽抱杆 园。
[0032] 优选地，所述在合适表达所述蛋白或多版的条件下具体为采用工业生产培养基 PPB诱导。
[0033] 优选的，所述步骤2)后，可从培养物中分离出所述蛋白或多肤，或者通过检测仪器 检测所述多种不同来源的蛋白或多肤。在本发明一实施例中，所述蛋白或多肤为GFP。
[0034] 通过常规的重组DNA技术即可构建所述多种不同来源的蛋白质或多肤的重组表达 载体，例如将目的基因片段插入所述表达载体的多克隆位点，并置于本发明所述启动子的 控制之下。所述目的基因片段应当至少包含多种不同来源的蛋白质或多肤的基因的完整编 码区。
[0035] 获得的转有重组表达载体的宿主细胞可W用常规方法培养，表达外源蛋白质或多 肤。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自已知的各种合适的培养基或培养液， 在适于宿主细胞生长的条件下进行培养并表达外源蛋白质或多肤。如果需要，可利用其物 理的、化学的和其它特性或添加纯化标签通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。运些 方法是本领域技术人员所熟知的。运些方法的例子包括但并不限于：用蛋白沉淀剂处理(盐 析方法）、离屯、、渗透破壁、超处理、超离屯、、分子筛层析(凝胶过滤）、吸附层析、离子交换层 析、高效液相层析化PLC)和其它各种液相层析技术及运些方法的结合。
[0036] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0037] 本发明的发明人，将前述启动子与GFP连接，转化枯草芽抱杆菌，检测启动子对外 源基因（或蛋白）表达的影响。通过检测GFP的表达结果证明，该启动子具有启动子的活性， 并受工业生产培养基PPB诱导活性增强。此外，本发明启动子与其他启动子进行比较，所诱 导表达的GFP量比其他启动子高65%~114%，外源蛋白或多肤在微生物的重组生产，并具 有受诱导可调控的活性特征。
【附图说明】
[0038] 图1是克隆了启动子P1398的表达质粒pMK4-P1398-g巧图。
[0039] 图 2 是质粒pMK4-奸P、PMK4-P1398-gf P、PMK4-P43-奸P、pMK4-Pxy 1 A-gf P 的构建流 程图。
[0040] 图 3 是克隆了 启动子P1398、P43、PxyiA 的表达质粒pMK4-P1398-gfp、pMK4-P43-奸P、 pMK4-PxylA-gfp在枯草芽抱杆菌中，在蛋白酶生产培养基培养条件下发酵后表达的巧光量 图。
【具体实施方式】
[0041] 在进一步描述本发明【具体实施方式】之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下 述特定的具体实施方案;还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体 实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法， 通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
[0042] 当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端 点W及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和 科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、 材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可W使用与本 发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实 现本发明。
[0043] 除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领 域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及 相关领域的常规技术。运些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等 MOLECULAR CL0NING:A LABORATORY MANUAL,Second edition,Cold Spring Harbor LaboratoiT Press,1989 and Third edition，2001;Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BI0L0GY，John Wiley&Sons,New York,1987 and periodic updates;the series METHODS IN ENZYMOLOGY,Academic Press,San Diego；Wolffe,CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTIONJMrd edition ,Academic Press, San Diego ,1998 !METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，畑romatin。.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.),Academic Press，San Diego,1999;和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY'Vol.119,Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press,Totowa，1999等。
[0044] 实施例1构建质粒PMK4-P1398-奸p、pMK4-P43-奸p、pMK4-P巧lA-gfp并在枯草芽抱 杆菌中表达绿色巧光蛋白GFP
[0045] 1. DNA片段的扩增
[0046] W2409-PstF(沈Q ID N0.2)和2409NdeR(SEQ ID ^.3)为引物，^1398基因组为 模板，扩增P1398;WP43-PstF(SEQ ID N0.4)和P43-XmaR(沈Q ID ^.5)引物，^9]\
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0访客 来自[中国] 2020年09月20日 06:10枯草杆菌在棉花种植上的应用
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