一个用于鉴定与内质网upr反应相关植物因子的基因及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及植物基因工程领域，特别的属于一种可用于鉴定本氏烟中与内质网 UPR反应相关植物因子的基因W及该基因的应用。
【背景技术】
[0002] 蛋白在内质网上翻译表达后往往需要进一步的折叠或修饰才具有生物学功能或 被运输到相应的亚细胞器中行驶功能。当在内质网上未折叠或错误折叠的蛋白大量积累 时，就导致了内质网的胁迫，从而引起了内质网的未折叠蛋白反应（Unfolded protein response, UPR)。除了机体自身的未折叠蛋白能引起UPR外，病原物的入侵(如病毒、细菌等） 和非生物胁迫也能引起机体的IPR反应。UPR反应的最终目的是为了让机体的内质网恢复功 能，缓解内质网上的胁迫，W及阻止错误的蛋白对细胞的毒害。然而当WR反应一直持续而 不能解除时，就能引起细胞的程序性死亡(Programmed cell death,PCD)。
[0003] 文献报道，一些植物病毒入侵寄主后能引起植物的WR反应，且UPR反应往往是由 病毒编码的单个蛋白引起的。如马铃馨X病毒(Potato virus X，PVX)编码的TG化3蛋白，宪 菁花叶病毒（Turnip mosaic virus,TuMV)编码的6K2蛋白和水稻黑条矮缩病毒（Rice black streaked dwarf virus,RBSDV)编码的plO蛋白都能引起植物的UPR反应。定量结果 显示表达了运些蛋白后，与WR相关的标志基因都被大量的上调了。植物发生WR的过程是 一个相对复杂的生理过程，现在已知的参与IPR的植物因子还是相当的有限，且很多是通过 同源分析酵母和哺乳动物的UPR因子得来。运就需要提供新的途径来筛选或发现W及验证 内质网IPR反应相关的植物因子。
【发明内容】
[0004] 本发明小组惊奇的发现一个大蒜X病毒(2015年采集于浙江省杭州市，采集人鲁宇 文KGarlic virus X)分离物编码的pll蛋白能够诱导UPR反应，并当其通过PVX过量表达 后，能引起与IPR相关的本氏烟的程序性死亡。利用运种死亡表型的差异可W做为筛选本氏 烟中与内质网UPR反应相关植物因子或者基因。
[0005] -方面，本发明提供一种含有PVX:pll侵染性克隆质粒在筛选本氏烟中与内质网 UPR反应相关植物因子中的用途。大蒜X病毒(Garlic virus X)分离物编码的Pll蛋白的基 因序列插入到PVX侵染性克隆载体PgRioe中获得过质粒载体在筛选本氏烟中与内质网UPR 反应相关植物因子中的用途，其中编码Pll蛋白的基因序列如SEQ N0:4所示。优选的，通过 酶切连接的方法，在该Pll基因两端引入ClaI和Sail,然后连接到用相同酶切酶切的PVX侵 染性克隆载体PgRioe中。
[0006] 另一方面，本发明提供一种大蒜X病毒(Garlic virus X)分离物编码的Pll蛋白的 基因序列在在筛选或鉴定本氏烟中与内质网WR反应相关植物因子中的用途，其中该序列 如沈Q NO:4所示。
[0007]本发明提供一种植物UPR相关因子的鉴定方法，该方法包括：利用大蒜X病毒 (Garlic virus X)分离物编码的pll蛋白的基因序列插入到PVX侵染性克隆载体PgRioe中 获得过质粒载体，其中编码Pll蛋白的基因序列如SEQ N0:4所示。
[000引在一些优选的方式中，植物WR相关因子为本氏烟bZIP60基因，其序列如SEQ NO: 7 所示。
[0009] 在一些优选的方式中，通过酶切连接的方法，在该Pll基因两端引入ClaI和Sail， 然后连接到用相同酶切酶切的PVX侵染性克隆载体PgRioe中。在一些优选的方式中，还获得 同样的对照质粒载体，该载体包括巧光蛋白基因（GFP)的质粒载体PVX = GFP质粒载体，所使 用的载体也是PgRioe。
[0010] 在一些优选的方式中，将bZIP60基因 3'末端300bp的序列通过限制性酶切位点 XbaI和SmaI连接插入到相同酶切位点的TRV RNA2载体上获得含有bZIP60基因的质粒载体。 在一些优选的方式中，使用TRV:00为对照质粒载体，即使用的载体为TRV RNA2空载体。
[0011] 优选的，分别将包括有Pll基因的克隆载体PgRioe和包括有bZIP60基因的TRV RNA2载体通过电击转化到农杆菌中。优选的，对获得的阳性农杆菌载体的表达菌液对烟草 叶片进行接种，其中先在两批烟草叶片上分别接种包括有bZIP60基因的TRV RNA2加TRV RNAl和TRV: 00加TRV RNAl的农杆菌表达菌液，然后再在同时在烟草植物上接种包括有Pl 1 基因的克隆载体PgRioe的农杆菌表达液。优选的，观察是否具有减缓作用。
[0012] 优选的，前述所有质粒所转化的宿主载体为农杆菌载体进行相关蛋白的表达。 [001引优选的，所述的植物为本氏烟烟草。
[0014] 在本发明中将一种新发现大蒜X病毒(Garlic virus X，GarVX)编码的Pll蛋白嵌 合到马铃馨X病毒(Potato virus X，PVX)中，根据接种了嵌合病毒后症状表型的差异在本 氏烟的病毒诱导基因沉默(virus induced gene silencing,VIGS)的植株中筛选出与内质 网未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)相关的植物因子。
[001引研究表明，该Pll蛋白能诱导本氏烟的UPR反应，并在PVX载体中过量表达时，能诱 发与UPR相关的细胞程序性死亡。当与UPR相关的细胞因子被下调后，PVX:pll诱导与UPR相 关的细胞程序性死亡的程度也会有相应的减轻，其表型与对照相比为坏死斑明显减少，从 而鉴别出与UPR相关未知的植物细胞因子。
[0016] 本领域的一般技术人员了解，本发明所使用的一些质粒载体也可W采用另外的别 的载体来使用，表达载体也可W是大肠杆菌，农杆菌，酵母菌等。植物可W是烟草，例如本氏 烟草，也可是是其他双子叶植物。
【附图说明】
[0017] 图1.为PVX载体(P曲106)图谱示意图。
[001引图2.PVX:pll在本氏烟中引起IP时目关的细胞程序性死亡的实验结果图。
[0019] 图3.定量PCR显示TRV:bZIP60的植株中bZIP60基因明显下调结果图。
[0020] 图4.沉默了 bZIP60植株在PVX:pll侵染过程中的坏死程度明显缓和的实验结果 图。
[0021] 有益效果
[0022] 本发明提供一种新的Pll蛋白W及含有该基因的表达载体，可W评估已知的IPR反 应的植物因子在细胞死亡中的作用和影响，还可W利用该载体筛选一些未知的W財直物因 子。
【具体实施方式】
[0023] 为了充分论述本发明的可行性，本发明举例进行说明本发明如何实现，但是运个 举例并不构成对本发明的限制，本发明的范围体现在本发明的权利要求中。
[0024] 实施例子l:pll基因的克隆
[0025] 通过本实验室已经报道的大蒜X病毒余杭分离物序列（在genbank登录的序列编 号:AJ292229)进行同源分析，AJ292229序列为如下序列（SEQ N0:1):
[0026]
[0027]设计如下引物获得Pll基因全长序列：pll-f〇rward:5'ATGA GCTTCACTCC CCC 3' (沈Q N0:2);pll-forward:5'TTAG TGGGGTATAG TAGA 3'（沈Q N0:3)。
[002引Pll蛋白全长序列的获得如下步骤：
[0029] 1.首先将取得的大蒜病样用Trizol法提取总RNA，方法如下：
[0030] (1).取适量样品置2ml离屯、管中，用液氮速冻后迅速研磨，然后加入1ml Trizol (lml/1 OOmg样品），剧烈振荡混匀，室溫放置5min。4°C，13,000巧m离屯、5min。
[0031] (2).取上清于1.5ml E卵endo计管中，加200iil体积氯仿，剧烈混匀15sec，室溫静 置2~3miru4°C ,13,000巧m离屯、30min。
[0032] (3).底层为氯仿相，中层为蛋白相，上层是含RNA的无色水相。取上层水相于新的 离屯、管中，加入1/5体积氯仿，振荡混匀，室溫静置2~3miru4°C ,13,000巧m离屯、30min。
[0033] (4).将上层水相转入一新的离屯、管，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，-70°C放置 化。4°C ,13,000巧m离屯、30min。
[0034] (5).弃上清，加入1ml预冷的75%乙醇（用RNase-打ee水配制），洗涂沉淀。4°C，13， 000巧m 离屯、5min。
[0035] (6).重复步骤5-次，彻底洗净残留盐份。
[0036] (7).弃上清，室溫惊干，加适量RNase-打ee水溶解。
[0037] 2.用步骤1提取的总RNA反转录合成CDNA第一链，具体操作如下表的配比和条件： 「00381
LUUW」 将上还试刑依次加入KNase-化ee EP菅甲，混匀后，42心111，721：日111111。完成后用十 PCR扩增获取Pll基因序列，PCR扩增的试剂配比如下：
[0042] 悠巧浩片熙讲巧席别細Il吿巧浩的Pll甚巧全长席别加下WRQ NO.4).
[0040]
[0041]
[0043]
[0044] 实施例子2:载体构建
[0045] l.PVX:pll质粒载体的构建
[0046] PVX表达Pll的载体构建是通过酶切连接的方法如下：在Pll基因（SEQ N0:4)两端 引入限制性酶切位点ClaI和Sail,然后连接到用相同酶切酶切的PVX侵染性克隆载体 pGR106(Gene bank基因序列号:AY297843)中（图1)，获得PVX:pll质粒，引物设计如下：口11-ClaI-forward:5'ATCGATATGA GCTTCACTCC CCC 3'(SEQ NO：5)；piI-Sal!-forward:5' GTCGACTTAG TGGGGTATAG TAGA 3'（沈Q N0:6)。获得PVX:pll质粒，具体结构如图I所示。
[0047] 按照上述相同的方法，构建另一个对照质粒载体，其中Pll基因被常用的巧光蛋白 基因(GFP)(该序列是常用公知的基因序列，再次不在重复叙述)序列替代获得PVX:GFP质粒 载体作为对照。
[004引 2.TRV:VIGS-bZIP60质粒载体的构建。
[0049] 本氏烟中 bZIP60 基因 NibenlOlScf 24096g00018.1)基于烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus,TRV)的病毒诱导基因沉默(Virus Induced Gene Silencing,VIGS)的载体 构建方法如下(bZIP60也是UPR反应中的一个重要的标记基因）：
[0050] 将bZIP60基因3'末端30化P的序列通过限制性酶切位点XbaI和SmaI连接插入到相 同酶切位点的TRV RNA2载体