一种北沙参多糖及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明公开了一种北沙参多糖及其制备方法和应用，涉及多糖类技术领域。北沙参多糖的分子量为26.3 kDa；北沙参多糖的单糖组成和摩尔比为：鼠李糖：半乳糖：葡萄糖=2.05：1.00：7.06；并提供了北沙参多糖的一级结构重复单元。本发明北沙参多糖具有提取工艺简单、组分纯度高、抗肿瘤和抗氧化活性好、毒副作用小的优点，适用于抗氧化或抗肿瘤新药的开发和应用。
【专利说明】
一种北沙参多糖及其制备方法和应用
技术领域
[0001]本发明涉及多糖类技术领域。
【背景技术】
[0002] 北沙参为伞形科植物珊瑚菜(Glehnia littoralis F. Schmidt ex Miq.)，以根入 药。北沙参味甘甜，是临床常用的滋阴药，养阴清肺，祛痰止咳。主治肺燥干咳、热病伤津、口 渴等症。主产于山东、河北、辽宁、内蒙古等地。别名莱阳参、海沙参、银沙参、辽沙参、苏条 参、条参、北条参。北沙参主要含香豆素类成分、佛手柑内酯、补骨脂素、花椒毒素及多糖等。 而多糖是其最主要的活性成分，总糖含量达70%以上。
【发明内容】
[0003] 本发明要解决的技术问题是提供一种北沙参多糖及其制备方法和应用，具有提取 工艺简单、组分纯度高、抗肿瘤和抗氧化活性好、毒副作用小的优点，适用于抗氧化或抗肿 瘤新药的开发和应用。
[0004] 为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是:一种北沙参多糖，北沙参多糖 的分子量为26.3 kDa;北沙参多糖的单糖组成和摩尔比为：鼠李糖:半乳糖:葡萄糖=2.05: 1.00:7.06;北沙参多糖的一级结构重复单元如下：
[0005] 上述北沙参多糖的制备方法，包括以下步骤： (1) 提取 取干燥的河北道地药材北沙参，粉碎，除去含有的脂溶性化合物;药材残渣蒸馏水提 取，浓缩，加入无水乙醇沉淀，干燥后得北沙参粗多糖； (2) 分离和纯化 a、 除蛋白； b、 除色素； c、 进一步分离和纯化，得到所述的北沙参多糖。
[0006] 优选的，进一步分离和纯化，包括： 1) 、透析:将除色素完毕的北沙参粗多糖装入透析袋，分别用自来水、蒸馏水透析，透析 后袋内液冷冻干燥后得北沙参二级粗多糖； 2) 、离子交换柱层析:使用DEAE-cellulose 52纤维素柱层析对北沙参二级粗多糖进行 分离纯化，收集，减压浓缩、透析和冷冻干燥，得到北沙参精多糖； 3)、凝胶柱层析:使用葡聚糖凝胶Sephadex G-IOO柱层析对北沙参精多糖进行纯化，收 集，得到组分单一的北沙参多糖。
[0007] 优选的，步骤（1)提取为：取干燥的河北道地药材北沙参，粉碎，使用体积分数为 95%的食用乙醇提取，除去含有的脂溶性化合物;药材残渣挥干乙醇，加入蒸馏水提取，水提 液减压浓缩，在搅拌条件下加入无水乙醇使最终乙醇体积含量为75-85%，在3_5°C下静置 22-26 h，离心，收集沉淀，冷冻干燥后得北沙参粗多糖。
[0008] 进一步优选的，步骤(1)提取为:取干燥的河北道地药材北沙参，粉碎，使用北沙参 6-10倍质量的体积分数为95%的食用酒精55-65 °C条件下提取2-3次，除去含有的脂溶性化 合物;药材残渣挥干乙醇，加入药材残渣18-22倍质量的蒸馏水，使用超声功率200-300 W的 超声波提取仪75-85°C条件下辅助提取15-20 min，然后在75-85°C恒温下水浴提取2.5-3.5 h，过滤后重复提取2-3次，合并水提液，减压浓缩至水提液体积的八分之一至十分之一;在 搅拌条件下加入无水乙醇使最终乙醇体积含量为75-85%，在3-5°C下静置22-26 h，离心，收 集沉淀，冷冻干燥后得北沙参粗多糖。
[0009] 优选的，步骤(2)分离和纯化中： a、 除蛋白为:将北沙参粗多糖溶于8-12倍质量的蒸馏水中，温度调至45-55°C，保持25-35 min，缓慢加入木瓜蛋白酶，调pH值为6，搅拌1.5-2.5 h后，温度调至85-95 °C，保持25-35 min，冷至室温，离心，收集上清液，即北沙参粗多糖溶液，再使用Sevag法除蛋白，北沙参粗 多糖溶液中加入氯仿和正丁醇，北沙参粗多糖溶液、氯仿和正丁醇的体积比例为25:5:1;震 荡15-25 min，静置，离心，去掉下层的有机层和中间层的白色蛋白；重复萃取操作直至中间 层无白色蛋白出现，在紫外分光光度计下200-400 nm扫描，在260-280 nm之间无吸收，说明 除蛋白完全； b、 除色素为:除蛋白后的北沙参粗多糖溶液用HPD-100型大孔树脂吸附色素;大孔树脂 先用无水乙醇浸泡，清洗，然后用蒸馏水彻底清洗，充分溶胀;除蛋白后的北沙参粗多糖溶 液的毫升数和大孔树脂的克数比例为12:1，静态吸附12 h，抽滤，减压浓缩，得到除色素的 北沙参粗多糖。
[0010] 优选的，步骤(2)分离和纯化中：1)、透析:将除色素完毕的北沙参粗多糖装入截留 量为3500 Da的透析袋，分别用自来水、蒸馏水透析48 h和24 h，透析后袋内液冷冻干燥后 得北沙参二级粗多糖。
[0011] 优选的，步骤(2)分离和纯化中：2)、离子交换柱层析:使用DEAE-cellulose 52纤 维素柱层析对北沙参二级粗多糖进行分离纯化，称取北沙参二级粗多糖，使用北沙参二级 粗多糖95-105倍质量的蒸馏水溶解，过0.45 μπι的微孔滤膜过滤，上清液上样于DEAE-cellulose 52 纤维素层析柱 ，分别使用蒸馏水和 0-0.8 M 的梯度 NaCl 溶液进行洗脱 ，流速设 定为0.5 mL/min，自动部分收集器收集，每管收集5.0 mL;苯酸-硫酸法跟踪检测北沙参多 糖的流出；以吸光度值为纵坐标，洗脱液管数为横坐标绘制洗脱曲线，收集第二个洗脱主 峰，减压浓缩、分别用自来水、蒸馏水透析48h和冷冻干燥，得到北沙参精多糖。
[0012] 优选的，步骤(2)分离和纯化中：3)、凝胶柱层析:使用葡聚糖凝胶Sephadex G-100 柱层析对北沙参精多糖进行纯化，称取北沙参精多糖，用95-105倍质量蒸馏水溶解，过0.45 ym的微孔滤膜过滤，上清液上样于Sephadex G-100层析柱，以蒸馏水为洗脱液，流速设定为 0.5 mL/min，自动部分收集器收集洗脱液，每管收集5.0 mL，苯酚-硫酸法跟踪检测多糖的 流出；以吸光度值为纵坐标，洗脱液管数为横坐标绘制洗脱曲线，收集第一个洗脱峰，得到 组分单一的北沙参多糖。
[0013]另一方面，本发明还提供了北沙参多糖在制备抗肿瘤药物或抗氧化活性药物中的 应用。
[0014]采用上述技术方案所产生的有益效果在于：本发明北沙参多糖具有提取工艺简 单、组分纯度高、抗肿瘤和抗氧化活性好、其对人肝癌细胞IfepG2的IC5q是43.26 yg/mL，毒副 作用小的优点，适用于抗氧化或抗肿瘤新药的开发和应用。
【附图说明】
[0015] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明； 图1是本发明北沙参多糖Sephacryl S-300 HR凝胶柱层析洗脱曲线图； 图2是本发明北沙参多糖的紫外-可见扫描图（700-200 nm); 图3是本发明北沙参多糖的红外谱图； 图4 A是本发明北沙参多糖的核磁谱图（1H-13C HSQC); 图4 B是本发明北沙参多糖的核磁谱图（1H-13C HMBC); 图5是本发明北沙参多糖的抗氧化活性(清除DPPH自由基)结果图； 图6是本发明北沙参多糖的抗氧化活性(螯合Fe2+)结果图； 图7是本发明北沙参多糖对人肝癌细胞HepG2的抑制活性(丨，_ n=：3〕图； 图8是本发明北沙参多糖抑制S18q荷瘤小鼠肿瘤生长实验各组肿瘤组织图； 图9是本发明S18q荷瘤小鼠体重变化曲线图。
【具体实施方式】
[0016] 实施例1 一种北沙参多糖，北沙参多糖的分子量为26.3 kDa;北沙参多糖的单糖组成和摩尔比 为：鼠李糖:半乳糖:葡萄糖=2.05:1.00:7.06;北沙参多糖的一级结构重复单元如下：
[0017] 上述北沙参多糖的制备方法，包括以下步骤： (1)提取 取干燥的河北道地药材北沙参500 g，粉碎，使用北沙参7.89倍质量的体积分数为95% 的食用酒精60°C条件下提取2次，除去含有的脂溶性化合物;药材残渣挥干乙醇，加入药材 残渣20倍质量的蒸馏水，使用超声功率260 W的超声波提取仪80°C条件下辅助提取15 min， 然后在80°C恒温下水浴提取3 h，过滤后重复提取2次，合并水提液，使用旋转蒸发仪减压浓 缩至水提液体积的十分之一;在搅拌条件下加入无水乙醇使最终乙醇体积含量为80%，在4 °C下静置24 h，5000rpm条件下离心10 min，收集沉淀，冷冻干燥后得北沙参粗多糖。
[0018] (2)分离和纯化 a、除蛋白：将北沙参粗多糖溶于10倍质量的蒸馏水中，温度调至50°C，保持30 min，缓 慢加入木瓜蛋白酶，调pH值为6，搅拌2 h后，温度调至90°C，保持30 min，冷至室温，5000rpm 离心15 min，收集上清液，即北沙参粗多糖溶液;北沙参粗多糖溶液使用Sevag法除蛋白，北 沙参粗多糖溶液中加入氯仿和正丁醇，北沙参粗多糖溶液、氯仿和正丁醇的体积比例为25: 5:1;剧烈震荡20 min，静置，用离心机5000rpm离心15 min，去掉下层的有机层和中间层的 白色蛋白；重复萃取操作5次，直至中间层无白色蛋白出现，在紫外分光光度计下200-400 nm扫描，在260-280 nm之间无吸收，说明除蛋白完全。
[0019] b、除色素:除蛋白后的北沙参粗多糖溶液用HPD-100型大孔树脂(沧州宝恩吸附材 料科技有限公司）吸附色素;大孔树脂先用无水乙醇浸泡，清洗，然后用蒸馏水彻底清洗，充 分溶胀;除蛋白后的北沙参粗多糖溶液的毫升数和大孔树脂的克数比例为12: l(v/w)，静态 吸附12 h，抽滤，减压浓缩，得到除色素的北沙参粗多糖。
[0020] C、进一步分离和纯化，包括： 1)、透析:将除色素完毕的北沙参粗多糖装入截留量为3500 Da的透析袋，分别用自来 水、蒸馏水透析48 h和24 h，透析后袋内液冷冻干燥后得北沙参二级粗多糖。
[0021 ] 2)、离子交换柱层析:使用DEAE-Cellulose 52纤维素(瑞典Pharmacia公司）柱层 析对北沙参二级粗多糖进行分离纯化，称取北沙参二级粗多糖，使用北沙参二级粗多糖100 倍质量的蒸馏水溶解，过0.45 μπι的微孔滤膜过滤，上清液上样于DEAE-cellulose 52纤维 素层析柱，分别使用蒸馏水和梯度NaCl溶液(0-0.8 M)的进行洗脱，流速设定为0.5 mL/ min，自动部分收集器收集，每管收集5.0 mL;苯酚-硫酸法跟踪检测北沙参多糖的流出；以 吸光度值为纵坐标，洗脱液管数为横坐标绘制洗脱曲线，收集第二个洗脱主峰，减压浓缩、 透析和冷冻干燥，得到北沙参精多糖。
[0022] 3)、凝胶柱层析:使用葡聚糖凝胶Sephadex G-100(瑞典Pharmacia公司）柱层析对 北沙参精多糖进行纯化，称取北沙参精多糖，用100倍质量蒸馏水溶解，过〇.45 μπι的微孔滤 膜过滤，上清液上样于Sephadex G-100层析柱，以蒸馏水为洗脱液，流速设定为0.5 mL/ min，自动部分收集器收集洗脱液，每管收集5.0 mL，苯酚-硫酸法跟踪检测多糖的流出；以 吸光度值为纵坐标，洗脱液管数为横坐标绘制洗脱曲线，收集第一个洗脱峰，得到组分单一 的北沙参多糖。
[0023] 实施例2 北沙参多糖的纯度验证： 经过旋光度法、紫外-可见光谱扫描法、凝胶柱层析(GPC)法验证北沙参多糖的纯度，结 果表明北沙参多糖为均一性良好的精多糖。在常温下(20°C)，在水中具有良好的溶解性，不 溶于乙醇、丙酮、乙醚等有机溶剂。
[0024]旋光度法验证北沙参多糖的纯度:经分离纯化后的北沙参多糖醇沉所得的20%和 40%乙醇沉淀物水溶液，测定其旋转角，计算其比旋光度，数值基本恒定，平均值为[(?^=-20.60° (c = 0.5 mg/mL，H2O)，表明纯化后多糖样品均一性良好。
[0025]凝胶柱层析(GPC)法验证北沙参多糖的纯度：见图1所示，由图1洗脱曲线图可知， 分离纯化后的北沙参多糖在Sephacryl S-300 HR凝胶柱层析中获得单一、对称的洗脱峰。 [0026]紫外-可见光谱扫描法验证北沙参多糖的纯度：见图2所示，由图2可知，在700 - 200 nm处，北沙参多糖的扫描曲线呈平滑曲线，并无明显的蛋白及核酸杂质吸收。
[0027] 实施例3 北沙参多糖的结构表征 采用完全酸水解、部分酸水解、高碘酸氧化-Smith降解、甲基化反应等化学分析方法； 红外光谱、气质联用、高效离子色谱、核磁共振等仪器分析技术，表征了北沙参多糖的化学 结构。
[0028] (1)北沙参多糖分子量的测定 采用凝胶渗透过滤法(GPC)测定多糖分子量，分别称取1.0 mg标准葡聚糖T4、T7、T10、 丁40、了70、了200，溶解于1.0 11^蒸馏水中，分别上凝胶柱56口1^(^7 3-300册（1.6\90.0 cm)，以蒸馏水作洗脱液，调节流速为0.3 mL/min，自动部分收集器收集每管0.6 mL，用苯 酚-硫酸法检测样品出峰液分布，计算各标准葡聚糖出峰的洗脱体积Ve，通过已知分子量为 200万的蓝葡聚糖来确定凝胶柱的空体积Vo,通过无水葡萄糖来确定凝胶柱的总柱体积Vt。 以有效分配系数(Kav)为纵坐标，以IgMw为横坐标作标准曲线，分配系数Kav由以下公式求 得：
式中：Ve:待测样品的洗脱体积;Vo:凝胶层析柱的空体积;Vt:凝胶柱层析柱的总体 积。
[0029] 精确称取北沙参多糖样品2.0 mg，溶于2.0 mL洗脱液，上Sephacry S-300 HR凝胶 层析柱，同上法测定多糖的分子量分布，根据所得的多糖样品的出峰洗脱体积，代入上述标 准曲线中，计算出样品的分子量为26.3 kDa。
[0030] (2)北沙参多糖的单糖组成 取北沙参多糖样品使用三氟乙酸完全酸水解后，进行HPAEC-PAD测定，经与标准单糖的 高效离子色谱保留时间对照，并根据各峰的保留时间和峰面积比计算出各单糖的组成和摩 尔比，为鼠李糖:半乳糖:葡萄糖=2.05:1.00:7.06。
[0031] (3)北沙参多糖的红外图谱如图3所示： 由图3可知:3436、2961、1641 ^413^0770^1为多糖的特征吸收峰。
[0032] (4)北沙参多糖的核磁共振图谱如图4A、图4B所示： 采用化学分析法（如完全酸水解、部分酸水解、高碘酸氧化-Smith降解、甲基化等）以 及仪器分析方法（如紫外光谱、红外光谱、核磁共振、气相色谱、气质联用、高效离子色谱 等)对多糖的初级结构进行表征，得到北沙参多糖的一级结构重复单元如下：
结构式中，A、B、C、D、E是代表对应核磁共振图谱（图4A、图4B)上面的吸收峰的符号。
[0033] 实施例4 北沙参多糖的抗肿瘤和抗氧化活性： 考察了北沙参多糖体外抗氧化活性，包括清除DPPH自由基活性和铁离子螯合能力测定 两个实验： (I)DPPH自由基清除活性 称取20.0 mg的DPPH试剂，加入无水乙醇溶解，用250 mL容量瓶定容至刻度，得到浓度2 X10-4 mol/L的DPPH溶液(4°C冰箱保存），96孔酶标板中，加入190 yL· DPPH，10 yL不同浓度 的抗坏血酸(维生素 C，Vc)以及样品（水溶，设终浓度梯度为1600、800、400、200、100、50、25、 〇 yg/mL)，反应总体积为200 yL，混合均匀后避光，水平摇床上振摇反应30 min，测定在490 nm波长下吸光度值的变化，每个浓度设3组平行，取平均值。对DPPH自由基的抑制率按下列 公式进行计算：
其中，A1为样品溶液+DPPH溶液;A2为样品溶液+无水乙醇;Ao为DPPH溶液+无水乙醇。 [0034]实验结果如图5所示。
[0035] (2)Fe2+螯合作用测试 取0.8 mL不同浓度的北沙参多糖样品水溶液，加入氯化亚铁溶液，涡旋均匀，然后加螯 合剂Ferroizine，混勾后于562 nm处测定吸光度值。然后取超纯水代替北沙参多糖样品水 溶液，加入氯化亚铁和Ferroizine，混勾后在室温下放置10 min，于562 nm处测定吸光度 值，作为空白对照组，乙二胺四乙酸(EDTA)作为阳性对照品。螯合作用计算公式如下： 铁离子螯合能力(％) = (A空白-A样品)/A空白X 100% 实验结果如图6所示。
[0036]从兔和图6结果显示:在25到1600yg/mL的浓度范围内，北沙参多糖具有较强的体 外抗氧化作用，并且呈现出良好的量效关系。
[0037] (3)体外抗肿瘤活性测试 人肝癌细胞HepG2 (购于中山大学医学院细胞库），采用MTT实验检测法，即将处于对数 生长期的肿瘤细胞，制成含有细胞3-4 X IO3个/mL单细胞悬液，分别接种于无菌的96孔板 中，100 UL/孔。置于5% C02,37°C培养箱中，培养12 h。设空白对照组(加等体积RPMI1640培 养液）、阳性对照组(顺铂)和给药组，每个浓度组3个复孔，加入药物，每孔总反应体积为200 μL。将其置5% CO2培养箱中，37°C培养48 h，实验终止前4 h加入20 uL的MTT(5.0 mg/mL)， 继续培养4 h。弃去上清液，加入二甲基亚砜200 μL7孔，置于振荡仪上振荡10 min，用酶标 仪于波长570 nm处测定吸光度值A57〇,按下列公式求出生长抑制率。
[0038] 生长抑制率(％)=(1 -给药组A57Q值/对照组A57〇)X100 使用人肝癌细胞HepG2细胞株检测了北沙参多糖的体外抗肿瘤活性，见图7所示，由图7 可知，北沙参多糖具有较强的抗肿瘤活性，其对人肝癌细胞IfepG2的IC5q是43.26 yg/mL。
[0039] (4)体内抗肿瘤活性测试 实验动物为昆明小鼠，雄性，体重18-22g。购于中山大学实验动物中心，许可证号:SCXK (粵）2011-0029。
[0040] 小鼠饲养于中山大学实验动物中心。摄食专用饲料，自由饮水。光照黑暗各12 h， 室温20~24°C，相对湿度40%~70%。每盒6只，每周更换2次垫底木肩，每周消毒2次给水瓶， 每日更换新鲜无菌水。适应性饲养7 d后进行实验。
[0041 ] a肿瘤模型建立 1)细胞复苏、接种 从液氮罐中取出Si8〇冻存细胞，37°C速融，转移入离心管中离心，800 rpmX 5 min，离 心完毕弃上清。加入I3BS缓冲液重悬后离心800 rpm X 5 min，离心完毕弃上清，重复一次。 加入PBS缓冲液重悬，台盼蓝染液染色后细胞计数。调整细胞浓度为3 X IO7 cells/ml。于超 净工作台中按0.2 ml/只接种于昆明小鼠腹腔。
[0042] 2)肿瘤细胞小鼠体内传代 10 d后，腹水形成。抽取小鼠腹水，台盼蓝染液染色后细胞计数。调整细胞浓度为2 X IO7个/ml。于超净工作台中按0.2 ml/只接种于昆明小鼠腹腔。传代两次后建立实验动物肿 瘤模型。
[0043] 3)建立实验动物肿瘤模型 取接种8 d生长良好的S18q小鼠，消毒其腹部皮肤，用无菌注射器抽吸腹水，生理盐水二 倍稀释，瘤细胞悬液为乳白色半透明状态，台盼蓝染色后用血球计数板在倒置式显微镜下 计数，活细胞数为98%以上，调整细胞浓度为2 X IO7个/ml。无菌条件下接种细胞悬液于小鼠 右前肢腋下，每只0.2 ml。
[0044] b实验分组和给药 将40只接种S18q细胞的小鼠称重，随机分为4组：空白对照组、阳性对照组（环磷酰 胺，CTX)、北沙参多糖低剂量组、北沙参多糖高剂量组，每组10只。
[0045] 接种24 h后，开始给药，给药容积为0.2 ml/10g。阳性对照组CTX剂量为25 mg/kg， 参照云芝多糖给药剂量200 mg/kg，设定北沙参多糖低、高剂量组分别为100、400 mg/kg，空 白对照组给予等量的0.5% CMC溶液，除阳性对照组腹腔注射给药外，其他三组灌胃给药。每 天固定时间给药1次并记录小鼠体重及活动情况，连续10 d。
[0046] c抑瘤率和脏器指数的计算 末次给药24 h后称体重，计算体重增加值;颈椎脱白处死小鼠，剖取瘤块、脾脏及胸腺 并称重，计算抑瘤率、脾脏指数及胸腺指数。公式如下： 抑瘤率(％) =(空白组瘤重-给药组瘤重)/空白组瘤重X 1 〇〇% 脾脏指数=小鼠脾重(mg)/小鼠体重(g) 胸腺指数=小鼠胸腺重(mg)/小鼠体重(g)。
[0047] d统计方法 所有数据均以均数土标准差丨:如)：表示。t检验采用SPSS11.5统计软件包完成，以 p〈0.05表示具有统计学意义。
[0048] e实验结果 北沙参多糖对小鼠 S18O移植瘤的生长抑制作用，见表1所示：
::注r;与空:白鄉照:组1?較，Cl.賅,，〇Jl·。 利用S18Q荷瘤小鼠模型对北沙参多糖体内抗肿瘤作用进行初步研究。实验结果表明：空 白对照组平均瘤重大于lg，阳性对照药环磷酰胺显著抑制&80移植瘤的生长，其瘤重与空白 对照组比较具有显著性差异(P〈〇. 01);北沙参多糖高低剂量组的抑瘤率分别为33.1%和 20.7%，其中高剂量组瘤重与空白对照组比较具有明显差异(p〈0.05)。各组肿瘤组织见图8 所示。
[0049] 北沙参多糖对Siso荷瘤小鼠体重的影响见图9所示。
[0050] 如图9所示:在给药过程中，阳性对照环磷酰胺组小鼠体重增加缓慢。而北沙参多 糖对S18q荷瘤小鼠的体重无显著影响。
[0051] 北沙参多糖对S18q荷瘤小鼠免疫器官指数的影响，见表2所示： 由表2可知：与空白对照组相比，阳性对照药环磷酰胺显著减小S18q荷瘤小鼠的脾脏指 数和胸腺指数(P〈〇. 01 )，而北沙参多糖对318〇荷瘤小鼠的脾脏指数和胸腺指数无显著影响。 :闺:与_自頻纖_
[0052] 本发明北沙参多糖具有提取工艺简单、组分纯度高、抗肿瘤和抗氧化活性好、其对 人肝癌细胞HepG2的IC5q是43.26 yg/mL，毒副作用小的优点，适用于抗氧化或抗肿瘤新药的 开发和应用。
【主权项】
1. 一种北沙参多糖，其特征在于:所述北沙参多糖的分子量为26.3 kDa;北沙参多糖的 单糖组成和摩尔比为：鼠李糖:半乳糖:葡萄糖=2.05:1.00:7.06;北沙参多糖的一级结构重 复单元如下：2. 如权利要求1所述的一种北沙参多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 提取 取干燥的河北道地药材北沙参，粉碎，除去含有的脂溶性化合物；药材残渣蒸馏水提 取，浓缩，加入无水乙醇沉淀，干燥后得北沙参粗多糖； (2) 分离和纯化 a、 除蛋白； b、 除色素； c、 进一步分离和纯化，得到所述的北沙参多糖。3. 根据权利要求2所述的一种北沙参多糖的制备方法，其特征在于，所述进一步分离和 纯化，包括： 1) 、透析:将除色素完毕的北沙参粗多糖装入透析袋，分别用自来水、蒸馏水透析，透析 后袋内液冷冻干燥后得北沙参二级粗多糖； 2) 、离子交换柱层析:使用DEAE-cellulose 52纤维素柱层析对北沙参二级粗多糖进行 分离纯化，收集，减压浓缩、透析和冷冻干燥，得到北沙参精多糖； 3) 、凝胶柱层析:使用葡聚糖凝胶Sephadex G-100柱层析对北沙参精多糖进行纯化，收 集，得到组分单一的北沙参多糖。4. 根据权利要求2所述的一种北沙参多糖的制备方法，其特征在于，步骤(1)提取为:取 干燥的河北道地药材北沙参，粉碎，使用体积分数为95%的食用乙醇提取，除去含有的脂溶 性化合物;药材残渣挥干乙醇，加入蒸馏水提取，水提液减压浓缩，在搅拌条件下加入无水 乙醇使最终乙醇体积含量为75-85%，在3-5°C下静置22-26 h，离心，收集沉淀，冷冻干燥后 得北沙参粗多糖。5. 根据权利要求4所述的一种北沙参多糖的制备方法，其特征在于，步骤(1)提取为:取 干燥的河北道地药材北沙参，粉碎，使用北沙参6-10倍质量的体积分数为95%的食用酒精 55-65Γ条件下提取2-3次，除去含有的脂溶性化合物；药材残渣挥干乙醇，加入药材残渣 18-22倍质量的蒸馏水，使用超声功率200-300 W的超声波提取仪75-85°C条件下辅助提取 15-20 min，然后在75-85 °C恒温下水浴提取2.5-3.5 h，过滤后重复提取2-3次，合并水提 液，减压浓缩至水提液体积的八分之一至十分之一;在搅拌条件下加入无水乙醇使最终乙 醇体积含量为75-85%，在3-5 °C下静置22-26 h，离心，收集沉淀，冷冻干燥后得北沙参粗多 糖。6. 根据权利要求2所述的一种北沙参多糖的制备方法，其特征在于，步骤(2)分离和纯 化中： a、 除蛋白为:将北沙参粗多糖溶于8-12倍质量的蒸馏水中，温度调至45-55°C，保持25-35 min，缓慢加入木瓜蛋白酶，调pH值为6，搅拌1.5-2.5 h后，温度调至85-95 °C，保持25-35 min，冷至室温，离心，收集上清液，即北沙参粗多糖溶液，再使用Sevag法除蛋白，北沙参粗 多糖溶液中加入氯仿和正丁醇，北沙参粗多糖溶液、氯仿和正丁醇的体积比例为25:5:1;震 荡15-25 min，静置，离心，去掉下层的有机层和中间层的白色蛋白；重复萃取操作直至中间 层无白色蛋白出现，在紫外分光光度计下200-400 nm扫描，在260-280 nm之间无吸收，说明 除蛋白完全； b、 除色素为:除蛋白后的北沙参粗多糖溶液用HPD-100型大孔树脂吸附色素;大孔树脂 先用无水乙醇浸泡，清洗，然后用蒸馏水彻底清洗，充分溶胀;除蛋白后的北沙参粗多糖溶 液的毫升数和大孔树脂的克数比例为12:1，静态吸附12 h，抽滤，减压浓缩，得到除色素的 北沙参粗多糖。7. 根据权利要求3所述的一种北沙参多糖的制备方法，其特征在于，步骤(2)分离和纯 化中：1)、透析:将除色素完毕的北沙参粗多糖装入截留量为3500 Da的透析袋，分别用自来 水、蒸馏水透析48 h和24 h，透析后袋内液冷冻干燥后得北沙参二级粗多糖。8. 根据权利要求3所述的一种北沙参多糖的制备方法，其特征在于，步骤(2)分离和纯 化中：2)、离子交换柱层析:使用DEAE-cellulose 52纤维素柱层析对北沙参二级粗多糖进 行分离纯化，称取北沙参二级粗多糖，使用北沙参二级粗多糖95-105倍质量的蒸馏水溶解， 过0.45 μπι的微孔滤膜过滤，上清液上样于DEAE-cellulose 52纤维素层析柱，分别使用蒸 馏水和0-0.8 Μ的梯度NaCl溶液进行洗脱，流速设定为0.5 mL/min，自动部分收集器收集， 每管收集5.0 mL;苯酚-硫酸法跟踪检测北沙参多糖的流出；以吸光度值为纵坐标，洗脱液 管数为横坐标绘制洗脱曲线，收集第二个洗脱主峰，减压浓缩、分别用自来水、蒸馏水透析 48h和冷冻干燥，得到北沙参精多糖。9. 根据权利要求3所述的一种北沙参多糖的制备方法，其特征在于，步骤(2)分离和纯 化中：3)、凝胶柱层析:使用葡聚糖凝胶Sephadex G-100柱层析对北沙参精多糖进行纯化， 称取北沙参精多糖，用95-105倍质量蒸馏水溶解，过0.45 μπι的微孔滤膜过滤，上清液上样 于Sephadex G-100层析柱，以蒸馏水为洗脱液，流速设定为0.5 mL/min，自动部分收集器收 集洗脱液，每管收集5.0 mL，苯酚-硫酸法跟踪检测多糖的流出；以吸光度值为纵坐标，洗脱 液管数为横坐标绘制洗脱曲线，收集第一个洗脱峰，得到组分单一的北沙参多糖。10. 如权利要求1所述的一种北沙参多糖的应用，其特征在于，北沙参多糖在制备抗肿 瘤药物或抗氧化活性药物中的应用。
【文档编号】A61P39/06GK105859903SQ201610280824
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月29日
【发明人】景永帅, 张丹参, 吴兰芳, 戎欣玉
【申请人】河北科技大学