通过测量代谢的质谱法抗药性测定的制作方法

通过测量代谢的质谱法抗药性测定的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种使用质谱法测定微生物对抗生素的抗药性的方法。通过质谱法确定含有抗生素的培养基中微生物引起的具体营养成分的减少或改性，从而确定微生物的代谢。因此，并不是对微生物进行质谱分析，而是对培养基进行质谱分析。接受质谱观察的特殊营养成分是存在抗生素的培养基中微生物代谢的指示剂，因此也是其敏感性或抗药性的指示剂。
【专利说明】
通过测量代谢的质谱法抗药性测定
技术领域
[0001 ]本发明涉及一种使用质谱法测定微生物对抗生素的抗药性的方法。
[0002]定义
[0003]本文使用“道尔顿”，而非法定的“统一的原子质量单位”(u)，“道尔顿”在国际计量局上一版(第八版，2006年)“国际单位制(SI)”文件中添加，与统一的原子质量单位处于同等地位。如已经注意到的，这样做主要是为了允许使用千道尔顿和毫道尔顿等类似单位。
[0004]为简单起见，本中只使用了术语“肽”，但相关分子也可称为蛋白质。在现有技术中，从较轻的肽到较重的蛋白质过渡并不固定，没有明确定义。
[0005]此处使用的术语微生物(microorganisms)在下文中也称为细菌和微生物(microbes)，其是指用显微镜下看见的小生物体，例如，包括细菌、单细胞真菌(例如酵母菌)、显微藻类和原生动物等。单数形式的“微生物”(microorganism)或“微生物” (microbe)用于单个微生物细胞以及微生物株系或基因相同微生物细胞的分离物。复数形式的“微生物” (microbes)通常表示待分析的多个微生物细胞。
[0006]通常按照一般说法，术语“抗生素”是指用于治疗微生物感染性疾病的药理学活性物质。
【背景技术】
[0007]自从首次使用青霉素作为药理学抗生素以来，微生物株系对各种抗生素逐渐产生各种抗药性，或从其他微生物获得抗药性，即微生物获得能够削弱抗生物质的效力，或使其彻底失效的特性。而遗憾的是，与此同时，抗药性非常普遍;现在医院中的微生物大多具有抗药性。某些情况下，可以预测在医院内传播的微生物对医院常用抗生素的抗药性，然而，这并不适用于在医院外获得的感染。测定抗药性的商用方法在含有抗生素的培养基上检测细菌生长区，或检测含有抗生素的液体培养物中与生长相关的不透明度变化，这非常耗时，通常需要一个工作日以上;但快速测定微生物样本或微生物分离物抗生素抗药性却极其重要。快速光谱测定法正在研发中。
[0008]专利说明书DE10 2006 021 493 B4(V.M.Govorun和J.Franzen，2006，对应于GB2438066 B,US 8,293,496 B2，下文称为“Govorun”)披露了用于测定微生物抗药性的质谱法，其中，在添加和未添加抗生素的培养基中培养微生物，然后通过质谱法测量并比较微生物的蛋白质分布曲线。
[0009]特别是为了检测对β-内酰胺酶(青霉素和相关物质)的抗药性，人们已经开发出质谱法，这在文件DE 10 2010 023 452 B4(M.Kostrzewa等人)和DE 10 2011 012 060 Al中有所披露。这些方法基于测量位于微生物附近的具体基质的分解，这些基质与抗生素相似。
[0010]在申请文件EP 13002450.8(K.Sparbier 等人)和 EP 13002699.0(K.Sparbier 和C.Lange)中，描述了测定抗药性的更多质谱测定方法，通过测量存在抗生素时同位素标记营养成分的吸收或微生物量增加实现:吸收同位素标记营养成分或生物量增加则表明存在抗药性。这些方法并不限于具体类型的抗药性，因此不仅是表明对内酰胺酶的抗药性。因此本文以引用的形式包含这两份申请文件。这些文献中还大体介绍了抗药性的问题并具体介绍了质谱法测定抗药性的问题，还说明了快速抗药性测定的重要性。
[0011]迄今为止，人们发现，这两份申请文件中的方法对不同微生物和不同抗生素均能产生优异的结果;但通常的情况是，目前(还)没有普遍适用的方法。因此明确需要更多测定抗药性的方法。

【发明内容】

[0012]发明目的
[0013]本发明的目的是提供一种质谱法和合适的合成培养基，从而能够以可靠、低成本以及(最重要的)快速的方式测定微生物对一种或多种抗生素的抗药性。对于生长快速，因而也特别危险的病原体而言，如果可能，抗药性的测定应低于一小时。
[0014]发明简述
[0015]本发明提供了一种使用质谱法测定微生物对抗生素抗药性的方法，其中，所述微生物在含有特定浓度抗生素的培养基中生长。本方法的特征在于，其涉及采用质谱法确定培养期间培养基的至少一种营养成分是否减少，或者是否有新出现并增加的营养成分的化学改性变体。营养成分的减少或营养成分化学改性变体的增加表明在这一特定浓度下对抗生素有抗药性。可通过甲基化、酰化、乙酰化、氧化或相似反应产生化学改性变体，但具体来说通过营养成分的分解产生化学改性变体。新物质的出现及增加通常比已存在营养成分的减少更易于测量。
[0016]优选的营养成分是肽，测定其减少或化学改性。具体而言，使用具有D-氨基酸核心的肽，通过质谱法测定仅包含此核心多肽的形成和增加。还可使用由同位素标记氨基酸构成的肽，其中，通过质谱法测定培养基中长度缩短的同位素标记肽的形成。可借助于以测定剂量添加的参考物质，来测定营养成分的减少或化学改性变体的增加。化学改性变体的测量通常不需要参考物质，但也可通过与未改性营养成分比较来完成测量。可在培养完成后，以测定剂量添加一种或多种参考物质。参考物质优选为D-氨基酸组成的肽。
[0017]在一个实施方案中，微生物在包含抗生素的第一培养基中经过预培养，然后经过预培养的微生物在第二培养基中进一步生长。然后通过质谱法测量第二培养基营养成分的分解或营养成分化学改性变体的增加。
[0018]在另一个实施方案中，微生物在存在抗生素的情况下经过预培养，然后添加另一种营养成分。通过质谱法测量这种营养成分的分解或这种营养成分化学改性变体的增加。另一种营养成分优选为肽，添加这种营养成分之后，紧接着向培养基添加分泌性肽酶的抑制剂。
[0019]可以将待分析的微生物均分，均分后的部分在不含抗生素的第一培养基和包含抗生素的第二培养基中同时生长。优选让待分析的微生物在含不同浓度抗生素的多个培养基中生长，以确定抗药性强度。还可以将微生物分成更多份数，然后让其在相应数量的培养基中同时生长，一个培养基不含任何抗生素，其他培养基分别含不同浓度的不同类型抗生素。
[0020]本发明还提供了一种合成培养基，其包含根据本发明的方法所需的适当营养成分，特别是含有D-氨基酸核心的肽。
[0021]因此本发明提供的方法与上文引用的两个申请文件不同，并不基于Govorun的方法;本发明的目的是，在微生物培养基存在抗生素的情况下，例如通过酶分解等方法测定微生物周围环境中特殊营养成分的减少或具体营养成分化学改性变体的增加，从而通过质谱法测定存活微生物的代谢。因此，并非对微生物进行质谱分析，而是对培养基的成分进行质谱分析。在本文中，通过质谱观察到的具体营养成分和改性产物称为“指示剂”。它们是培养基中的微生物在存在抗生素时完整或受损代谢的指示剂。
[0022]微生物从其环境中吸收营养成分，这些营养成分的一部分产生能量，一部分合成用于微生物内部结构的物质。蛋白质、脂肪，尤其是碳水化合物，用作微生物的营养成分。借助不同机制，较小的分子可直接通过细胞壁吸收，对于较大分子，可使用更复杂的方法，包括通过分泌酶进行体外消化。当代谢完整时，还可通过氧化、酰化、甲基化或乙酰化来改变营养成分。
[0023]只要微生物在存在抗生素的培养基中仍然具有完整的代谢，则培养基中的至少某些营养成分将减少或者以改性形式出现;因此可将适当选择的营养成分作为微生物代谢正常或异常的指示剂，并在相应组成的培养基中通过质谱法对其进行观察。当抗生素使代谢机能停止，因而使生命机能停止时，至少如果之前分泌的酶不能继续作为催化剂，则指示剂的减少或改性基本停止。可测量之前分泌的酶。如果存在抗生素时，指示剂未继续减少，并且如果改性形式不再增加，则表明微生物对这种抗生素敏感。本发明基于使用质谱法测量培养基中这些指示剂的减少或这些指示剂改性形式的出现。
[0024]指示剂应该易于电离，在质谱中可清晰识别，优选作为营养物被微生物吸收，并且存在的量不是很大，从而可定量跟踪其减少。应当还可以容易地检测指示剂的化学改性形式。指示剂的吸收或改性不能受易于吸收的过剩营养所限制。例如，如果将肽用作指示剂，则培养基不应包含易于吸收的氨基酸成分。
[0025]可通过同位素标记增强指示剂的可检测性，尤其在使用能够进行碎片离子分析的质谱仪时。如果使用同位素标记指示剂，则通过质谱法还可有效地观察到指示剂的外部酶解。还可合成指示剂，该指示剂提供无法进一步分解的预定降解产物并作为质谱的特殊指示剂。
[0026]为了量化指示剂的减少，以精确的量添加合适的参考物质。本身无法被微生物分解或吸收的物质可用作参考物质。例如，与指示剂相似但比指示剂长或短一个氨基酸并且仅包含D-氨基酸而不是天然L-氨基酸的肽，可用作参考物质。这意味着，天然肽酶无法攻击它们。此外，优选仅在培养完成后添加参考物质，以避免任何消化。还可用同位素标记参考物质。与参考物质相比，指示剂以预期的程度减少，或指示剂的化学改性变体出现，表明待分析微生物对所使用浓度的抗生素有抗药性;当抗生素的浓度高于最低抑菌浓度(MIC)时，敏感微生物不会表现出指示剂减少。
[0027]用作指示剂的最佳营养成分取决于微生物种，但这些种通常已知，因为抗药性的测定通常在微生物种的鉴定之后。
[0028]也可使用基质辅助激光解吸(MALDI)和相关方法以及电喷射电离(ESI)或其他类型的电离作为电离方法。对于MALDI，在制备期间，在适当的样本载板上干燥培养基的成分以及基质。通过ESI，喷射液态培养基。可使用配备这些类型电离的离子源的所有质谱仪。
[0029]为了至少粗略估计抗药性强度，可使用添加了不同浓度抗生素的培养基。为测试对多种抗生素的抗药性，可以同时制备含有多种抗生素以及多种抗生素混合物的多个培养基，如有必要，甚至每个培养基都具有不同浓度的抗生素。
[0030]还可提供具有合适指示剂和不同抗生素的现成培养基，以及参考物质溶液。如果用带样本点的市售样本载板进行MALDI电离，其具有预制的薄层基质，这些薄层可能已经包含测定量的参考物质。
【附图说明】
[0031]图1示出了根据本发明鉴定微生物并测定其对(此处)两种抗生素ABl和AB2的抗药性的方法流程图的实例。
【具体实施方式】
[0032]如上所述，本发明提供的方法不基于Govorun的方法，与上文引用的两篇申请文件不同。本发明的目的在于测定存在抗生素的微生物培养基中特殊营养成分的减少或特殊营养成分化学改性变体(例如通过酶反应)的出现或增加，这种特殊营养成分在本文中称为“指示剂”。这样就可通过质谱法测定存活微生物的代谢。因而并不是对微生物或其成分进行质谱分析，而是优选仅对培养基的成分进行质谱分析，例如，通过重力使液体中的微生物沉淀后，或通过离心或过滤除去微生物后。
[0033]微生物可通过不同方式从它们的周围吸收营养成分。营养成分的一部分用来产生能量，一部分通过合成物质的合成来构建微生物的内部结构。蛋白质、脂肪和碳水化合物都可以作为微生物的营养成分。营养成分的吸收有不同的方式，有时非常复杂，包括营养成分的化学改性或酶解，这通常在微生物细胞外进行。
[0034]古细菌、酵母菌、革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的细胞壁具有非常不同的结构，但通常均具有硬质弹性壁结构(对于细菌而言，该结构包含肽聚糖，一种多糖和四肽的相对多孔网状结构)。此外，它们还具有外膜和内膜，内含嵌入式蛋白质(例如孔蛋白)，该蛋白的用途有很多，主要用于运输分子穿过细胞壁，尤其是细胞膜。在自然情况下，微生物的细胞壁只能透过气体和重量低于几百道尔顿非常小的中性分子。除非借助帮助，否则对于离子和多数生物活性物质而言，它们是不可逾越的屏障。然而，所有生命过程和具体细胞功能均取决于参与物质或粒子选择性交换的细胞及其环境。因此，存在可让分子通过细胞壁的极具选择性的机制，例如通道或所谓的载体。
[0035]对于真核微生物而言，内吞作用是运输大分子到较小粒子的特殊运输过程。内吞作用是细胞壁内陷过程的术语，其中，单个细胞或区室吞没液滴，液滴中溶解了某些物质:大分子或较大营养粒子到其他较小细胞。在内陷过程结束时，所谓的内体被夹断或被夹断且被推入细胞内部，并成为内膜系统的一部分。因此，该细胞将一部分周围培养基吸收到其内部。同样重要的是受体介导的(或受体控制的)内吞作用，其中，细胞表面上的特殊受体负责辨别要吸收的粒子。内吞作用与胞吐作用相反，后者则是将诸如代谢物等不再需要的物质释放到细胞外。只要细胞壁面积大小保持相同，则内吞作用和胞吐作用通常处于平衡状
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[0036]尤其对于细菌和酵母菌而言，通过分泌酶(“胞外酶”)也可在外部分解较大的分子，或通过氧化、酰化、乙酰化或甲基化将较大的分子改性，从而让这些分子可以穿过细胞壁运输。这些改性产生的分子也适合作为完整或受损代谢的指示剂。
[0037]如果微生物能在培养基中存活并且具有完整的代谢，那么无论营养究竟怎样被吸收，被吸收的营养都会使培养基中某些营养成分的浓度降低;可通过质谱法观察这些营养成分，将其作为微生物代谢正常或异常的指示剂。如果减少基于化学改性(例如酶解)，则还会出现分解或改性产物，并且也能够通过质谱法观察它们。当抗生素引起代谢机能停止，并因此使生命机能也停止时，指示剂向微生物细胞内的运输也会停止。除非通过之前分泌的酶继续催化这些过程，否则指示剂的降解和分解产物的形成也会停止。因此，如果在存在抗生素的一小段时间后，营养成分未进一步减少，或分解和改性产物不再增加，则说明微生物对这种抗生素敏感。本发明基于使用质谱法测量培养基中这些指示剂的减少或改性。
[0038]如上所述，由于酶解会在培养基中产生之前不存在的分解产物，因此还可通过质谱法观察指示剂的酶解，从而能够测定抗药性。如果指示剂已进行同位素标记，则可以找到指示剂进行同位素标记的部分。详细而言，指示剂可具有特殊结构，这种结构可释放能够被轻松识别的分解产物。举例来说，作为指示剂的肽可具有这样的结构:其中，中间部分具有大约六到十个D-氨基酸核心，至少在一端接有几个L-氨基酸。因为分泌性蛋白酶仅可降解L-氨基酸，所以包含D-氨基酸的核心不会被消化。之后，这个核心肽在质谱中就会以一种之前未检测到的新物质(随着时间推移)出现。很多不同的肽均可作为指示剂，只要所有在所述肽具有相同的D-氨基酸核心，并且在其末端具有微生物需要的不同L-氨基酸即可。之后可通过质谱法检测D-氨基酸的核心并测量它的增加。在本文中，不管肽是在细胞外被分解，还是在微生物细胞内被分解并再次分泌难消化的分解产物，都是不重要的。
[0039]根据本发明方法的细菌培养最好在完全合成的培养基中进行，这种合成培养基的质谱非常干净，没有太多化学背景噪声。合成培养基通常在一升水中含有大约10克葡萄糖，作为能量来源和合成的原材料。原则上，细菌可以通过消化葡萄糖自己合成内源性蛋白质和肽；因此必须添加大约0.58的1(2即04作为钾和磷的来源，添加大约Ig的NH4Cl作为氨基酸中氮的来源，添加0.2g的MgSO4作为酶的硫和镁的来源，以及必须添加几种微量元素。然而，该合成过程会消耗大量能量;如果培养基中已经存在氨基酸、可消化的肽或蛋白质或其他可消化的营养物质，则微生物会避免这一过程。例如，如果只有少量肽，但没有个别氨基酸，则可以将该肽作为指示剂。包含大约八到十二个氨基酸的肽是特别优选的；这对应于大约1000到1400道尔顿的质量。例如，如果分别具有十个氨基酸的两种肽均可作为指示剂，则应选择包含所有20个氨基酸的肽。或者可以使用三种或多种肽，它们以微生物中主要存在的比例包含所有氨基酸。可使用一种肽作为指示剂，也可同时使用多种肽作为指示剂，因为在培养基的质谱中可同时检测到它们。
[0040]为了获得高的质谱灵敏度，还可使用磷脂，尽管这些磷脂不包含任何氨基酸。还可添加衍生化后易于电离因而使质谱鉴定灵敏度较高的肽。
[0041 ]此外，很多细菌需要生物素(维生素H;质量m=244Da)、烟酸(维生素B7;m =123Da)、硫胺素(维生素BI ;m=335Da)、对氨基苯甲酸(m= 137Da)、泛酸(维生素B5 ;m =219Da)、吡哆胺(维生素B6;m=168Da)和氰钴维生素(维生素B12;m=1355Da)的维生素混合物。这些维生素也可用作指示剂。
[0042]用作指示剂的最佳营养成分取决于微生物种，但微生物种通常已知，因为抗药性的测定通常在微生物种的鉴定之后。
[0043]作为指示剂添加的化合物，其浓度应该较低，这样即使存在少量微生物，并产生少量代谢回转(turnover)，也可轻松检测到这些化合物的减少。出于同样原因，由于微生物是在琼脂中通常以菌落的形式培养以进行鉴定，因此微生物通常以相同的形式存在，所以应在尽可能少量的液体培养基(只有几微升)中添加微生物。但是，这些量必须精确测量，以添加参考物质。还可以收集相同微生物种的几个菌落并将其添加到培养物中。
[0044]为了量化指示剂的减少，精确测定剂量添加合适的参考物质。本身无法被微生物分解或吸收的物质(例如由于保护基团)可用作参考物质。尤其合适的是仅由D-氨基酸构成的肽。尽管这些物质难以消化，但却几乎无法阻止微生物吸收这些物质，因此仅在培养结束时添加参考物质是有利的，这样可避免培养基中这些参考物质的浓度降低。通过参考物质测量到指示剂以预期的程度减少，或降解产物以预期的程度增加，表明被分析的微生物对所使用浓度的抗生素具有抗药性;如果抗生素的浓度高于最低抑菌浓度(MIC)，则敏感微生物不会表现出指示剂减少。如图1的流程图所示，在此处有利的是还准备不含任何抗生素的培养基，用以测量微生物引起的指示剂的自然减少或变化，以便进行比较。
[0045]上文已经提到，事实上存在一个过渡期。即使抗生素的浓度远高于最高抑制浓度，含有抗生素的培养基中的细菌不会立即停止所有代谢。它们通常必须先吸收抗生素或者让抗生素以其他方式起作用。为了避免指示剂在这一阶段降解或改性，可以利用抗生素进行预培养，且之后仅添加指示剂。这种预培养的最佳持续时间必须通过实验方法确定。
[0046]但取决于培养基的成分，也可能在此预培养时已经分泌蛋白酶，并在添加指示剂后以催化的方式分解指示剂，因而(至少暂时)给人以代谢完整的印象。在这种情况下，有益的是，在预培养后使用抗生素冲洗微生物并将其放进具有指示剂和抗生素的新鲜培养基中。可以通过已知的方法仔细离心或过滤进行冲洗。
[0047]还可在预培养后添加分泌性蛋白酶的抑制剂，以使其失效。必须对抑制剂的剂量进行测量，从而确保抑制剂不会同时阻止存活微生物继续分泌蛋白酶。也可在之后通过反过来抑制抑制剂的物质来中和任何过量的抑制剂。
[0048]指示剂和参考物质均应易于电离，并且在质谱中具有能够轻松识别的峰值。正如上文所述，磷脂具有极高的质谱灵敏度。通过参考物质，还可覆盖较大的浓度范围。例如，可使用比例为100:10:1或25:5:1的三种参考物质。这对测量浓度从零向上增加的分解产物尤其有利。
[0049]电离较大有机分子的所有方法均可用作电离方法，尤其是基质辅助激光解吸(MALDI)和相关方法以及电喷雾电离(ESI)。对于MALDI，在制备期间，在适当的样本载板上干燥少量培养基以及基质物质。对于ES I，喷射液态培养基，例如，通过所谓的纳米ES I从小毛细管尖端喷射。配备这些类型电离的离子源的所有质谱仪均可使用。
[0050]在微生物彻底抗药性和彻底敏感性之间存在一个中间阶段;在这一阶段，生长受到影响，但未被彻底抑制。为了估算出微生物抗药性的强度，可以测量抗生素的实际抑菌浓度。抗生素的MIC值(完全敏感微生物在多小时暴露后的最低抑菌浓度)在很大程度是已知的;但实际抑菌浓度可能与该值有所偏离，因为不可能等到抗生素作用达到平衡，这需要几个小时;而且随着抗药性强度的增加，MIC值也增加。要测量实际抑菌浓度，可使用添加各种浓度抗生素的培养基，例如浓度对应于已知MIC值的I XMIC、10 XMIC和100 XMIC。经验表明，使用所述方法，如果微生物为完全敏感，则仅在浓度为I XMIC时即可观察到对微生物生长的抑制。如果抗药性较弱，仅在10XMIC浓度以上即可抑制微生物，但如果抗药性非常强，即使在100XMIC浓度下仍可检测到生长。可根据指示剂的减少或变化看出这种效果。这意味着对于中间抗药性，在不同抗生素浓度下存在不同的生长。
[0051 ]如果不以渐增浓度实施本方法，据发现10 XMIC浓度特别合适。
[0052]为了测定抗药性，优选具有含优选指示剂的现成合成培养基。它们之中已经添加了不同类型的抗生素。也可提供含有参考物质的现成溶液。若用带样本点的市售样本载板进行MALDI电离，其具有预制的薄层基质，这些薄层可能已经包含测定量的参考物质。然后必须放入测定量的培养基。以小瓶市售的预制量基质可能也已经包含参考物质。
[0053]这种方法非常快速。微生物通常需要大约20分钟的滞后时间来对培养基做出调整，如果微生物是抗药性的，则再过20分钟即可观察到指示剂的显著减少或分解产物的增加。通常由倍增时间只有20分钟左右生长快速的微生物引发危险感染。
[0054]为了测试对多种抗生素的抗药性，可以制备具有多种抗生素的多个培养基。如有必要，甚至每种抗生素均具有不同浓度。准备和测量来自多个培养基的样本所需的额外时间几乎对培养时间本身没有任何影响。
[0055]对于多重抗药性细菌(例如:MRSA，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)的快速测试来说，可提供含有多种类型抗生素混合物的培养基。如果微生物在此混合物中生长，说明具有多重抗药性。
[0056]通过基质辅助激光解吸(MALDI)电离干燥的培养基成分要求在样本载板上提前制备薄层基质，或制备基质溶液。市售基质通常具有不使用超声则难以溶解的缺点。因此，现在市面上有精确测定量的小瓶纯化的冻干基质。使用这些产品，在添加溶剂后，基质立即溶解，并且溶液浓度恰当，立等可用。如本发明中所定义的，可将精确测定量的至少一种参考物质添加到这些产品的基质中，以便定量指示剂的分解或变化。在用于制备MALDI样本的设备中，以精确的测定量，在不产生接触的情况下，将基质溶液施加到培养基的干燥细胞成分中。带有基质薄层的样本载板(已有市售)还可包含测定量的参考物质。将每个薄层分别施加到相互间有适当间距，且每个直径约为两毫米的小样本区。
[0057]图1示出了测定抗药性方法顺序的一个典型的实例。在此处所示方法中，微生物在琼脂(101)上进行培养基。菌落微生物经过收集(102)、裂解，然后处理成MALDI样本(103)。采集质谱(104)，通过比较该质谱与参考谱(105)鉴定微生物。在常规实验室中，从收集菌落到完成鉴定只需10分钟至30分钟，具体时间取决于要同时鉴定的微生物样本数量。为了测定抗药性，可同时收集相同微生物的多个菌落(106)。这些菌落在培养基中经过混合，然后分配至不同种类的培养基(107)。在该图示中制备三种培养基:一种培养基不含抗生素
(108)，另外两种培养基分别含有抗生素Abl (109)和Ab2(110)。在该实例中，培养基已包含指示剂。不言而喻，还可制备含有其他抗生素的其他培养基。如果还要测定抗药性的强度，也可制备含有不同浓度抗生素的培养基。所有培养基都在最佳温度下提前制备，以使微生物不会休克，加热不会导致时间延迟。培养期持续时间取决于微生物的滞后时间和倍增时间(世代周期)，它在微生物鉴定后是已知的。培养只需持续I至3段倍增时间。对于生长快速的微生物来说，20至40分钟左右已经足够。
[0058]添加参考物质后，将不同培养基中的培养基样本处理成MALDI样本，然后采集质谱
(111)。使用不含抗生素的微生物培养基的质谱(108)来确定指示剂的正常减少或分解产物的增加，这主要取决于未知的已接种微生物的数量。在添加参考物质(111)和制备MALDI样本(112)后，获得培养基(109)和(110)的质谱(113)。通过这些质谱，与不含抗生素的培养基中指示剂的减少比较，推断出指示剂是否减少。含抗生素的培养基中指示剂减少表明存在抗药性。
[0059]目前为止，已经通过MALDI电离法实施该方法。MALDI的显著优点是几乎只形成单电荷分子离子。这意味着，尽管在500至2000道尔顿首选质量范围内出现100至300个峰值，质谱也不过载。可将带MALDI离子源的任何类型质谱仪用于此，例如飞行时间质谱仪以及离子阱质谱仪。尤其占据优势的是串联质谱仪，这种质谱仪可破碎所选离子，从而明确检测指示剂。优选将同位素标记指示剂用于这些质谱仪。
[0060]然而，也可以采用其他类型的电离。尽管电喷雾电离(ESI)或通过电喷雾对固体样本进行直接表面电离(DESI)等喷雾类方法具有形成大量多电荷离子的缺点，容易使质谱过载，但是它们可与液相色谱(HPLC)或毛细管电泳(CE)等分离方法结合使用，以便通过分离物质获得结构更简单的质谱。
[0061]然而，还有几乎只产生单电荷离子的其他电离方法，例如化学电离(Cl)。化学电离既可与中性喷雾方法，又可与固体样本激光消融结合使用，同时也可与正交离子注入飞行时间质谱仪(OTOF-MS)结合使用。
【主权项】
1.一种使用质谱法测定微生物对抗生素的抗药性的方法，其中使所述微生物在含有特定浓度抗生素的培养基中生长， 其中，使用质谱法确定在培养期间培养基的至少一种营养成分是否减少或营养成分的化学改性变体是否增加，通过营养成分的减少或营养成分的化学改性变体增加表明对给定浓度的抗生素存在抗药性。2.根据权利要求1所述的方法，其中，通过与以测定量添加的至少一种参考物质进行比较从而确定营养成分的减少或营养成分化学改性变体的增加。3.根据权利要求2所述的方法，其中，参考物质是由D-氨基酸组成的肽。4.根据权利要求2或3所述的方法，其中，在培养完成后以测定量添加所述参考物质。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，使所述微生物在含有抗生素的第一培养基中经过预培养，然后在第二培养基中进一步使经过预培养的微生物进一步生长，并通过质谱法测量第二培养基中营养成分的分解或营养成分化学改性变体的增加。6.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，使所述微生物在含有抗生素的情况下经过预培养，然后再添加至少一种其他的营养成分，并通过质谱法测量所添加营养成分的分解或所添加营养成分的化学改性变体的增加。7.根据权利要求6所述的方法，其中，所添加的营养成分为肽，在添加营养成分之后立即添加已经分泌的肽酶的抑制剂。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，将所述微生物均分，均分后的各部分在不含抗生素的第一培养基和包含抗生素的第二培养基中同时生长。9.根据权利要求8所述的方法，其中，使所述微生物在含有不同浓度抗生素的培养基中生长，以确定抗药性强度。10.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，将所述微生物均分，均分后的各部分在不含抗生素和含有不同类型不同浓度抗生素的多个培养基中同时生长。11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中，所述培养基含有至少一种肽作为营养成分，并且确定该肽的减少或该肽的化学改性变体的增加。12.根据权利要求11所述的方法，其中，使用至少一种包含D-氨基酸核心的肽作为营养成分，并且通过质谱法测量仅包含该核心的肽的增加。13.根据权利要求11所述的方法，其中，使用至少一种包含同位素标记氨基酸的肽作为营养成分，并且通过质谱法测量培养基中长度缩短的同位素标记肽的形成。14.含有合成培养基用物质的包，其包含葡萄糖、维生素、盐和至少一种营养物质，所述营养物质的减少或变化可指示代谢是否完整。15.根据权利要求14所述的包，其中，至少一种营养是肽。16.根据权利要求15所述的包，其中，所述肽包含D-氨基酸核心。
【文档编号】G01N33/68GK105916995SQ201580004915
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2015年1月14日
【发明人】马库斯·科斯切娃, 卡特里·斯帕比尔
【申请人】布鲁克道尔顿有限公司