用于在小体积生物样品中测定痕量抗生素的微生物学方法
【专利摘要】用于在小体积生物样品中测定痕量抗生素的微生物学方法，其包括测定抗生素针对金黄色葡萄球菌的最小抑制浓度(MIC)，所述抗生素选自二甲胺四环素、环丙沙星、卡那霉素、四环素和苯唑西林。将所述细菌在Mueller?Hinton肉汤(MHB)中培养过夜，随后将所述培养物稀释至0.5McFarland标准(1.5x108细胞/mL)。之后，将所述抗生素以200μL的终体积添加至96孔板并在37℃下孵育18小时。测定吸光度并将结果表示为相对于包含所述生物样品和所述细菌培养物的对照的抑制百分比，所述生物样品进而选自尿、血液、滑液、眼房水或脑脊液(CSF)。获得表示细菌生长抑制百分比相对于抗生素浓度的曲线，并通过“四参数逻辑曲线(4PL)”进行调整，得到所述生物样品中所述抗生素的浓度值。所述方法甚至测定出生物样品中量为ng/mL水平的抗生素。
【专利说明】
用于在小体积生物样品中测定痕量抗生素的微生物学方法
技术领域
[0001]本发明涉及用于测定小体积生物样品中的痕量抗生素的微生物学方法。
【背景技术】
[0002]大量研究已证实，脊髓胶质细胞(spinalglia)在慢性疼痛的发生和持续中发挥作用。与此观点相符，提出对脊髓中的胶质细胞功能进行药理学抑制可能抑制疼痛的脊髓机理。已经表明，不同的药物除用作抗生素(二甲胺四环素、阿莫西林、新霉素、头孢曲松)之夕卜，还表现出抗炎活性。这使得药物可用于慢性疼痛的研究。通常，这些抗生素经鞘内施用于患有慢性疼痛病症的大鼠，到达这些动物中具有非常小容积(约8 O至1 O μ L)的隔室(compartment)。通过经典方法例如高效液相色谱法(h i gh performance liquidchromatography，HPLC)来测定这些抗生素具有很大挑战，因为在这种情况下，应对样品中存在于脑脊液中的成分进行清除，例如蛋白质、肽或其他妨碍其用于HPLC色谱的组分。此夕卜，由于仅一份用于HPLC的样品就已耗尽大鼠的所有脑脊液，因而，无法实现抗生素的动力学研究。
[0003]另外，该方法还可用于测定其他生物流体例如尿、血液、滑液、眼房水等中的抗生素。
[0004]与质谱偶联使用HPLC来检测生物样品或其他样品中的痕量抗生素也是可能的，但是检测所需的体积较大(在mL范围内)。与通过HPLC方法进行的测定相比，微生物学方法是简单、灵敏且节约成本的替选。
[0005]特别地，在现有技术中，已公开了通过使用0.1至0.6ml血清样品在40分钟至1.5小时内进行测量的确定抗生素(卡那霉素和庆大霉素)血液水平的测定。该原理是基于对含有大量受试生物接种物的培养物中的PH下降进行的测量。抗生素抑制细菌生长，从而导致发酵受到抑制。抑制程度反映为培养基中的pH变化，这一变化与所添加抗生素的浓度相关。参见，S.Faine和D.C.Knight在The Lancet 中的 “Rapid microb1logical assay ofantib1tics in blood and other body fluids”，1968年8月17日，第375-378页。
[0006]通过使用Delvotest SP-NT和Copan Milk Test来对牛乳中抗生素水平进行筛选的测定也是已知的。这些抑制测定由含有嗜热脂肪芽胞杆菌(B a c i I I u sstearothermophilus)孢子和营养物质的琼脂安瓿或微板组成。在添加所研究乳的情况下，孢子发芽并且产生碳酸。这种酸导致安瓿中的溴甲酚紫指示剂从紫色变成黄色。因此，孵育之后的黄色安瓿指示为阴性样品。抗生素的存在抑制了细菌生长并且安瓿中琼脂的颜色仍为紫色，则指不了阳性结果。Delvotest SP-NT和Copan Milk Test由SP Delvotest和Delvotest Milk Control Stat1ns(MCS)开发。参见Validat1n and comparison of theCopan Milk Test and Delvotest SP-NT for the detect1n of antimicrobials inmilk.Marie-Helene Le Breton,Marie-Claude Savoy-Perroud Jean-MarcDiserens.Analytica Chimica Acta 586(1-2):280-283，(2007)。
[0007]另一已知的测定是基于在接种的琼脂中，抗生素对参照细菌的抑制作用的浓度依赖性变化，所述参照细菌为枯草芽孢杆菌(B.subtil is )ATCC6633、金黄色葡萄球菌(S.aureus)ATCC 6538p和表皮葡萄球菌(S.epidermidis)ATCC 12228。结果表不为相对于抗生素浓度的平均抑制圈(以mm计)。参见，Applicat1n of microb1logical assay todetermine pharmaceutical equivalence of generic intravenous antib1tics.Andres F.Zuluaga，Maria Agudelo，Carlos Rodriguez^POmar Vesga.BMC ClinicalPharmacology 2009，9:1doi:10，1186/1472-6904-9-1。
[0008]此外，CN1858232公开了用于检测农产品中的抗生素残留的技术，特别是以试剂盒形式开发的微生物学检测可食性动物组织中的磺胺类药物残留的方法。该方法包括制备培养基I和培养基II;用培养基I和培养基II形成培养基，其使用作为工作微生物的巨大芽孢杆菌(Baci I lus megaterium)、用于质控的新霉素纸片和协同性甲氧节啶溶液。该技术提供了检测简单、灵敏度高且货架期长的试剂盒。
[0009]EP0418113涉及用于检测样品中的抗菌化合物的微生物学测试试剂盒和方法，其特别地可用于食品或乳品工业。所述方法包括以下步骤:a)将所述样品与对所述抗菌化合物表现出提高的灵敏度的活细菌混合以形成混合物;b)在最佳生长条件下孵育所述混合物;c)用信号产生剂的水溶液稀释所述混合物，所述信号产生剂特别被选择用于检测所述细菌中存在的至少一种代谢标志物;d)将所述混合物孵育足够的时间以使所述时间信号被检测到;d)测量或检测所述混合物中的所述信号;e)将所述信号与同时进行步骤(a)至(d)的不含所述抗菌化合物的对照样品进行比较。
[0010]因此，提供用于基于小体积生物样品(10至20μυ来测定抗生素而无需任何预先准备的高灵敏度微生物学方法将是有利的。
[0011]附图简述
[0012]图1示出了基于五种抗生素之浓度的金黄色葡萄球菌生长抑制(％)分布曲线，每种抗生素测定三次。点为平均值土标准偏差(SD)。
[0013]图2示出了基于五种受试抗生素之浓度的大肠杆菌(E.coli)生长抑制(％)分布曲线。可以看出，大肠杆菌对所有受试抗生素的灵敏度均较差。因此，使用金黄色葡萄球菌来进行其余的实验(每种抗生素测定三次，点为平均值±SD)。
[0014]图3示出了通过向由图1获得的二甲胺四环素抗生素应用4PL曲线方程得到的曲线。由此，绘出了图4曲线。
[0015]图4示出了注射到小脑延髓池(cisternamagna)中的二甲胺四环素的动力学。可以看出，本发明的方法允许定量1至100ng/ml范围内的二甲胺四环素浓度。
[0016]发明详述实施例
[0017]根据临床实验室标准委员会(Institutefor Clinical Laboratory Standard)建议的方案在96孔板中通过微稀释法来测定二甲胺四环素、环丙沙星、卡那霉素、四环素和苯挫西林抗生素针对ATCC金黄色葡萄球菌(Staphy1coccus aureus)ATCC 6538和大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC 1129的最小抑制浓度(minimum inhibitory concentrat1n,MIC)。简言之，将细菌在Muel Ier-Hinton肉汤(MHB)中培养过夜，并稀释至0.5McFarland(1.5xl08细胞/mL)。将不同的抗生素添加至在96孔板中的细菌培养物，直至终体积为200μL。将该板在37°C下孵育18小时，并在ELISA读数仪(Thermo Labsystems Multiskan，FC型)中测定吸光度。将结果表示为相对于包含脑脊液和细菌培养物的对照的抑制百分比。在两种受试微生物菌株中，葡萄球菌经选择对二甲胺四环素最灵敏。结果显示，可例如以高达ng/ mL水平测定脑脊液(CSF)中的二甲胺四环素。
[0018]还获得表示细菌生长抑制百分比相对于施加于每个孔的抗生素浓度的曲线。随后，使用称为“四参数逻辑曲线(4PL)”的曲线拟合分析来获得生物样品的抗生素浓度值。
[0019]实施例
[0020]脑脊液(CSF)收集:通过经皮小脑延髓池穿刺来收集脑脊液。通过相同的途径进行二甲胺四环素注射。
[0021]曲线拟合:对由图1获得的二甲胺四环素抗生素应用四参数逻辑曲线(4PL)分析:[0022 ] y = (max-min)/1+( x/ECso) AHlllslope+min，解出 x:
[0023]X = EC50((-max+y)/(min-y) A (1/Hlllslope)
[0024]其中:
[0025]Min=曲线底部
[0026]Max=曲线上部
[0027]EC5q=曲线在最小参数和最大参数的中间处的X值。将其称为半最大有效浓度。
[0028]Hillslope =表征曲线在其中点处的斜率。
[0029]根据上述内容，生成图4。
[0030]在Sprague-Dawley大鼠中使用二甲胺四环素(MC)(属于四环素家族的抗生素)来进行CSF的药代动力学研究。简言之，通过经CSF内(intra CSF)向正常大鼠注射lmg/mL的MC溶液，随后在时间为零、1、10和18小时时对CSF取样。可观察到，在所有时间均检测到MC。在18小时时，仍可检测到69ng/mL的浓度(图4)。
【主权项】
1.用于在小体积生物样品中测定痕量抗生素的微生物学方法，其包括如下测定抗生素针对金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)的最小抑制浓度(MIC)，所述抗生素选自二甲胺四环素、环丙沙星、卡那霉素、四环素和苯唑西林:将所述细菌在Muel Ier-Hinton肉汤(MHB)中单独培养以随后将所述培养物稀释至0.5McFarland标准(1.5xl08细胞/mL)，之后添加所述抗生素并在37°C下孵育18小时，然后测定吸光度并将结果表示为相对于包含所述生物样品和所述细菌培养物的对照的抑制百分比，所述生物样品进而选自尿、血液、滑液、眼房水或脑脊液(CSF);获得表示细菌生长抑制百分比相对于抗生素浓度的曲线，并通过“四参数逻辑曲线(4PL)”曲线拟合分析进行拟合，以得到所述生物样品的抗生素浓度值。2.权利要求1所述的方法，其中所述抗生素是二甲胺四环素。3.权利要求1所述的方法，其中所述生物样品是脑脊液。4.权利要求3所述的方法，其中所述脑脊液生物样品通过对大鼠进行经皮小脑延髓池穿刺来获得。
【文档编号】C12R1/445GK105916994SQ201480073398
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2014年12月11日
【发明人】洛雷托·萨纽埃萨查韦斯, 马塞拉·安德烈亚·威尔肯斯安万德特, 克劳迪奥·奥雷利奥·劳里都富恩萨利达
【申请人】智利圣地亚哥大学