用于减少背景的可降解适体的制作方法

用于减少背景的可降解适体的制作方法
【专利摘要】本公开提供了与用于在多种核酸操作中减少背景的可降解适体的用途相关的系统、方法、制品和组合物。具体地，提供了可以被降解到降解产物不能够或基本上不能够参与后续的反应诸如连接反应、引物延伸反应、扩增反应和测序反应的程度的适体。
【专利说明】
用于减少背景的可降解适体
[00011 本申请要求于2013年11月18日提交的美国临时专利申请号61 /905，546的权益，该 专利申请整体地通过引用并入本文。
技术领域
[0002] 本发明总体上涉及分子生物学领域。更具体地，本发明涉及使用可降解适体、引物 和其他寡核苷酸试剂制备和扩增核酸。
【背景技术】
[0003] 包括连接反应、扩增反应和测序反应的多种核酸操作中常见的一个问题是保持不 需要的反应的低背景并且防止或减少背景产物的形成。这些背景反应和产物可以例如由污 染、异常连接反应、引物-二聚体、引物错配引起，和由非最适反应条件的使用引起。来自不 期望的反应的背景产物或来自之前步骤的不需要的反应物的遗留物经常阻碍或阻止对核 酸样品的有效分析并且可能妨碍对核酸样品的进一步操作。在不太严重的情况下，背景可 以使对核酸样品的分析偏离或限制测序结果的置信度或准确度。
[0004] 在熟知的PCR扩增方法中，例如，具有由两个寡核苷酸延伸引物限定的边界或通过 向两端添加双链寡核苷酸适体的靶DNA片段通过多个酶促循环指数地扩增以形成靶DNA的 附加拷贝，所述靶DNA的附加拷贝充当相继循环的模板。PCR的主要限制在于生成了包括作 为扩增自连接的适体分子和非特异性引物引发事件(诸如核酸模板的随机引发和延伸引物 的自引发)的结果形成的副产物的背景。这样，当需要很高数量的扩增循环来扩增以相对低 的浓度存在的靶DNA时，非特异性引物引发事件的背景可以显著地阻碍PCR扩增的有效性， 并且甚至可以防止后续的操作和对扩增产物的分析。
[0005] 由多种核酸操作引起的背景反应和产物的存在有时可以通过在检测靶核酸之前 使用分离步骤来克服。在一些情况下，核酸操作的产物可以包括在一个步骤期间有意地添 加以在该步骤期间操作核酸的试剂;然而，那些试剂可能对后续反应中的一个或多个是有 害的。关于PCR，例如，扩增的靶DNA产物与非特异性引物引发事件的产物的分离可以是成功 检测和分析扩增的靶DNA序列的先决条件。关于PCR，在添加用于第二个PCR反应中的引物或 其他寡核苷酸之前可能需要去除在第一个PCR反应中使用的寡核苷酸引物或其他寡核苷 酸。然而，使用一个反应之后和第二个反应或测定之前的分离步骤可能会降低过程的总效 率，其中反应收率可能受累，偏差或污染可能被引入到样品中，并且关于靶核酸的分析或使 靶核酸经受进一步操作的总时间和成本增加。例如，分离步骤可能使核酸产物经受在分离 和回收靶核酸期间的分子损失或产生或引入污染，从而损害对靶核酸的多种诊断性核酸分 析。因此，在某些情况下，可以优选地具有其中核酸扩增和检测发生在相同的反应容器中的 反应，无需进行背景产物分离，从而消除了由于转移以及无效结合和释放所导致的样品损 失。在复杂的分子程序期间，在检测之前可能需要多个中间分离步骤，导致样品的多次损失 和结果的延迟。

【发明内容】

[0006] 本发明允许通过使用适体来扩增具有至少一个双链区的分子，所述适体避免了一 些适体分子的限制，诸如具有形成可扩增的适体二聚体的倾向的那些适体分子。在某些方 面，本发明提供了用于与双链分子附接的惰性寡核苷酸，使得连接了寡核苷酸的分子能够 被修饰，诸如被扩增，例如通过聚合酶链式反应扩增。在将惰性适体与分子附接后，附接的 寡核苷酸变得有活性并且适合于至少部分地提供一条或多条可被采用用于扩增的序列，同 时破坏未附接的、游离的适体和任何适体二聚体。结果，在聚合酶链式反应过程中，游离的、 未附接的惰性适体和任何适体二聚体可以既不被引物引发也不用作PCR引物。这为用适体 修饰DNA分子和后续的扩增提供了新的条件。这些条件极大地减小了测定中的背景并且允 许使用纳克、皮克(picogram)、飞克（femtogram)或阿克(attogram)量的输入DNA〇
[0007] 在一个实施方案中，本发明提供了一种用于加工具有至少一个可裂解碱基的核酸 的方法，包括：（a)在至少一个可裂解碱基处形成脱碱基位点；（b)在所述脱碱基位点处在所 述核酸的主链中形成切口；和(c)去除邻接所述切口的至少一个核苷酸。此方法可以用来减 少由不期望的反应所引起的背景。在一些方面，邻接切口的至少一个核苷酸可以是在切口 的3 '侧。在其他方面，邻接切口的至少一个核苷酸可以在切口的5 '侧。在多个方面，核酸分 子可以是脱氧核糖核酸和/或核糖核酸。
[0008] 在实施方案的某些方面，核酸可以包含可降解适体。例如，可降解适体可以是部分 双链的寡核苷酸适体、双链的寡核苷酸适体、或茎-环寡核苷酸适体。在其中可降解适体是 茎-环寡核苷酸适体的方面中，茎-环寡核苷酸适体可以包含(a)包含至少一个可裂解碱基 的5'片段；（b)与所述5'片段的3'-端偶联的中间片段;和(c)与所述中间片段的3'-端偶联 的3'片段，其中所述5'片段和3'片段是至少80%互补的。在某些方面，5'片段和3'片段可以 是至少80%、85%、90%、95%或100%互补的。在一些方面，3'片段可以不包含可裂解碱基。 在一些方面，茎-环寡核苷酸适体的5'片段和中间片段可以每3-6个碱基包含一个可裂解碱 基。
[0009] 在一个方面，可裂解碱基可以是脱氧尿苷。在这个方面，在至少一个可裂解碱基处 形成脱碱基位点可以包括用尿嘧啶-DNA糖基化酶处理具有至少一个可裂解碱基的核酸。在 一个方面，在脱碱基位点处形成切口可以包括用脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶(例如，APE 1) 处理包含脱碱基位点的核酸。在一个方面，去除邻接切口的至少一个核苷酸可以包括用核 酸外切酶(例如，核酸外切酶I)处理包含切口的核酸。
[0010] 在一些方面，所述方法可以是在进行第二反应(例如，第二PCR反应、测序反应等） 之前加工用于第一反应(例如，降解在第一 PCR反应中使用的引物）中的核酸的方法，所述第 二反应利用所述第一反应的可期望产物或组分进行。
[0011] 在一个实施方案中，本发明提供了制备核酸分子的方法，包括：（a)提供双链核酸 分子；（b)将包含至少一个可裂解碱基的可降解适体的3'端连接至双链核酸分子的5'端以 产生附接了寡核苷酸的核酸分子；（c)在至少一个可裂解碱基处形成脱碱基位点；（d)在脱 碱基位点处形成切口；和(e)去除邻接切口的至少一个核苷酸。在一个方面，连接可以在附 接了寡核苷酸的核酸分子中产生切口。在多个方面，核酸分子可以是脱氧核糖核酸和/或核 糖核酸。在一个方面，附接了寡核苷酸的核酸分子可以被固定化(例如，非共价地)在固相载 体上。
[0012] 在实施方案的某些方面，核酸可以包含可降解适体，所述可降解适体可以包括 RNA、DNA或两者。例如，可降解适体可以是部分双链的寡核苷酸适体、双链寡核苷酸适体、或 茎-环寡核苷酸适体。茎-环寡核苷酸可以具有一个或多个发夹。在其中可降解适体是茎-环 寡核苷酸适体的方面中，茎-环寡核苷酸适体可以包含(a)包含至少一个可裂解碱基的5'片 段；（b)与所述5'片段的3'-端偶联的中间片段;和(c)与所述中间片段的3'-端偶联的3'片 段，其中所述5'片段和3'片段是至少80%互补的。在某些方面，5'片段和3'片段可以是至少 80%、85%、90%、95%或100%互补的。在一些方面，3'片段可以不包含可裂解碱基。在一些 方面，中间片段可以包含至少一个可裂解碱基。在某些方面，茎-环寡核苷酸适体的5'片段 和中间片段可以每3-6个碱基包含一个可裂解碱基。这样，适体可以包含至少3、4、5、6或更 多个可裂解碱基，这取决于适体的长度。在一些方面，可裂解碱基可以是脱氧尿苷。在一个 方面，茎-环寡核苷酸可以包含已知序列。在具体的方面，茎-环寡核苷酸的5'端缺少磷酸 酯。
[0013] 在实施方案的一个方面，在至少一个可裂解碱基处形成脱碱基位点可以包括用尿 嘧啶-DNA糖基化酶处理具有至少一个可裂解碱基的核酸。在一个方面，在脱碱基位点处形 成切口可以包括用脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶处理包含脱碱基位点的核酸。在一个方面，去 除在切口 3'侧的至少一个核苷酸可以包括用核酸外切酶处理包含切口的核酸。在另一个方 面，去除在切口5'侧的至少一个核苷酸可以包括用核酸外切酶处理包含切口的核酸。脱嘌 呤/脱嘧啶核酸内切酶可以是APE 1。核酸外切酶可以是核酸外切酶I、核酸外切酶III或λ核 酸外切酶。在实施方案的一个方面，酶或化学处理必须与在裂解步骤期间或在后续步骤中 可期望的分子产物的使用相容(例如，不干扰）。
[0014] 在一个方面，实施方案的方法可以包括扩增经加工和/或已制备的核酸分子的至 少一部分。扩增可以包括聚合酶链式反应。
[0015] 在一个方面，根据本发明的实施方案加工和/或制备的核酸分子可以进一步被修 饰。例如，核酸可以进行克隆，即，将经修饰的分子掺入到载体中。所述掺入可以在被修饰的 分子的末端发生，所述被修饰的分子是通过在反向重复序列内的核酸内切酶裂解生成的。
[0016] 在一个方面，本发明的实施方案的方法可以在单一合适的溶液中和/或在没有外 来操作的条件下进行。在此方面，所述溶液可以包含下列中的一种或多种:连接酶、尿嘧啶-DNA糖基化酶、脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶、核酸外切酶、ΑΤΡ和dNTP。在另一个方面，本发明 的实施方案的方法的两个或更多个步骤可以顺序地进行。
[0017] 在一个实施方案中，有一种试剂盒，其包含：（a)包含至少一个可裂解碱基的核酸； (b)尿嘧啶-DNA糖基化酶；（c)脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶;和(d)核酸外切酶。在一个方面， 脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶可以是APE 1。在一个方面，核酸外切酶可以是核酸外切酶I或核 酸外切酶III。
[0018] 在一些方面，核酸可以包含可降解适体，所述可降解适体可以是部分双链的寡核 苷酸适体、双链的寡核苷酸适体、或茎-环寡核苷酸适体。在某些方面，可裂解碱基可以是脱 氧尿苷。
[0019] 在其中可降解适体是茎-环寡核苷酸适体的方面中，适体包含(a)包含至少一个可 裂解碱基的5'片段；（b)与所述5'片段的3'-端偶联的中间片段;和（c)与所述中间片段的 3'_端偶联的3'片段。5'片段和3'片段可以是至少80%、85%、90%、95%或100%互补的。在 一个方面，3'片段可以不包含可裂解碱基。在一个方面，中间片段可以包含至少一个可裂解 碱基。在一个方面，茎-环寡核苷酸适体的5'片段和中间片段可以每3-6个碱基或每4-5个碱 基包含一个可裂解碱基。这样，适体可以包含至少3、4、5、6或更多个可裂解碱基，这取决于 适体的长度。在一个方面，茎-环寡核苷酸可以包含已知序列。在具体的方面，茎-环寡核苷 酸的5'端缺少磷酸酯。
[0020] 连接实施方案可以被进一步定义为包括:在所述双链核酸分子上产生可连接的末 端;在所述茎-环寡核苷酸上产生可连接的末端；以及使所述茎-环寡核苷酸的可连接的末 端的一条链与所述核酸分子的末端的一条链连接，从而在所述附接了寡核苷酸的核酸分子 中产生非共价接合，如切口、缺口、或5'端侧翼结构。在另外的方面，所述方法包括在所述核 酸分子上产生平末端;在所述茎-环寡核苷酸上产生平末端；以及使所述茎-环寡核苷酸的 平末端的一条链与所述核酸分子的平末端的一条链连接，从而在连接了寡核苷酸的核酸分 子中产生切口。
[0021] 本发明的另外的实施方案包括通过本发明的方法制备的DNA分子文库。
[0022] 在特殊的方面，本发明针对用于制备分子集合体的系统和方法，所述分子尤其是 适合于扩增的分子，诸如利用所述分子上的已知序列的扩增。在具体的实施方案中，寡核苷 酸包含已知序列。
[0023] 在另一个实施方案中，存在一种试剂盒，所述试剂盒被装在合适的容器中，所述试 剂盒包含本发明的一种或多种组合物和/或包含适用于本发明的至少一种方法的一种或多 种组合物。
[0024] 如本说明书中所用，"a/an( -)"可以意指一个(种)或多个(种）。如本文在一项或 多项权利要求中所用，当结合词语"包含"使用时，词语"a/an( -)"可以意指一个(种)或多 于一个(种）。
[0025] 除非明确地表示指的是单独的替代方案或这些替代方案相互排斥，否则在权利要 求书中术语"或"的使用是用于意指"和/或"，尽管本公开支持指的是单独的替代方案以及 "和/或"的定义。如本文所用的"另一个(种)"可以意指至少第二个(种)或更多个(种）。
[0026] 在整个本申请中，术语"约"用于表示值包括被用于测定所述值的装置、方法所固 有的误差变异或研究对象间存在的变异。
[0027] 根据以下详细说明，本发明的其他目的、特征以及优势将变得显而易见。然而，应 当了解的是，虽然详细说明和具体实施例表明了本发明的优选的实施方案，但是所述详细 说明和所述具体实施例仅是以举例说明的方式给出的，这是因为根据这一详细说明，落入 本发明的精神和范围内的各种变化方案和改动方案对于本领域技术人员来说将变得显而 易见。
【附图说明】
[0028] 下列附图形成本说明书的一部分并且被包括以进一步说明本发明的某些方面。通 过参考这些附图中的一个或多个，结合本文所提供的具体实施方案的详细说明，可以更好 地了解本发明。
[0029] 图1-本技术的过程的概述。（1)在连接的和游离的适体分子中在可裂解碱基（例 如，dU;由圆圈指示)处形成脱碱基位点。（2)在脱碱基位点处形成切口。（3)在切口位点处降 解核酸。
[0030] 图2A-C-尿嘧啶-DNA糖基化酶、脱嘌呤/脱嘧啶(AP)核酸内切酶和核酸外切酶的协 同活性。图2A-用APE 1和Exo I两者处理的样品。图2B-仅用ΕχοΙ处理的样品。图2C-仅用APE 1处理的样品。
[0031] 图3-对尿嘧啶-DNA糖基化酶处理的样品的热诱导降解。
【具体实施方式】
[0032] 本公开提供了与用于在多种核酸操作中减少背景的可降解适体的用途相关的系 统、方法、制品和组合物。具体地，提供了可以被降解到降解产物不能够或基本上不能够参 与后续的反应诸如连接反应、引物延伸反应、扩增反应和测序反应的程度的适体。可降解适 体可以是部分双链的寡核苷酸适体、单链的寡核苷酸适体、茎-环寡核苷酸适体、或可以通 过连接和/或引物延伸形成二聚体的任何类型的寡核苷酸适体。
[0033] 本发明提供了一些益处和优势，这些益处和优势包括下面的方面。本文所述的可 降解适体和酶促裂解方法将可裂解碱基在用于连接到靶核酸的适体设计中的用途延伸到 将适体简单降解成较短的寡核苷酸以外。具体地，本技术包括将未连接的适体和适体-二聚 体两者都降解成单个核苷酸。这对由适体-二聚体和不完全适体降解释放的寡核苷酸所导 致的背景都有明显的影响，这允许使用完全不相关的序列而不需要末端反向重复序列所引 起的抑制。在扩增所得的连接产物中，本技术可以被用作独立方法或与抑制PCR的抑制原理 相结合。值得注意的是，本文所述的方法与通过破坏寡核苷酸以减少由不想要的引物引起 的PCR污染来减少背景的方法是可区分的，所述寡核苷酸破坏是通过将脱氧尿苷掺入到不 想要的引物中使得以后可以使用尿嘧啶-DNA糖基化酶来破坏它们而实现的。
[0034] 定性观察和定量实验证明，连接被设计成容纳在连接位点近侧的通用序列的单一 适体或两个不同的适体可以对以下能力具有有益的作用:优先地扩增包含可控大小的靶插 入物的分子并且忽略不携带插入物的适体二聚体或包含具有很少信息价值或没有信息价 值的短插入物的分子的能力。这种现象称作抑制或抑制PCR。抑制是指对侧翼是末端反向重 复序列的小于特定大小的分子的选择性排除，其原因是当用于扩增的一条或多条引物对应 于整个重复序列或一小部分重复序列时，所述分子的扩增是无效的（Chenchik等，1996 ; Lukyanov等，1999; Siebert等，1995; Shagin等，1999)。此种现象的原因在于生产性PCR引物 复性和片段的互补末端的非生产性自复性之间的平衡。在侧翼的末端反向重复序列具有固 定大小的情况下，插入物越短，抑制效应越强，反之亦然。同样，在固定的插入物大小的情况 下，末端反向重复序列越长，抑制效应越强(Chenchik等，1996; Lukyanov等，1999; Siebert 等，1995;Shagin等，1999)。凭借通过连接和/或引物延伸将末端反向重复序列连接到核酸 分子的两端，可以对具有所需的最小尺寸的靶插入物相对于不期望的适体二聚体或短插入 物副产物的引物复性和延伸效率实现精确的控制，如美国专利7，803，550所述。
[0035] 举例来说，可降解适体可以用于核酸文库的制备，例如，用于大规模平行 (NextGen)测序的核酸文库，其中靶核酸样品被连接到含有一个或多个可裂解碱基诸如脱 氧尿嘧啶(dU)的莖-环寡核苷酸适体上。可以使用本技术修饰的适体的实例包括在Makarov 等的美国专利8,440,404中描述的那些，该专利通过引用并入本文。通过采用酶的组合以同 时或序贯的方式产生脱碱基位点、在脱碱基位点处形成切口或缺口、并且将全部或基本上 全部的所得到的缩短的寡核苷酸降解成单个核苷酸可以实现对未连接的茎-环寡核苷酸适 体和所形成的任何适体二聚体的完全降解或基本上完全降解。
[0036]所述方法可以包括下列序贯或同时的酶促步骤(参见，图1):
[0037] 1)使用糖基化酶(例如，尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG))在可裂解碱基(例如，dU)处形 成脱碱基位点。
[0038] 2)使用脱嘌呤/脱嘧啶(AP)核酸内切酶(例如，APE 1)在脱碱基位点处形成切口。
[0039] 3)使用核酸外切酶(例如，Exo I或Exo III)降解切口位点处的核酸。
[0040] 关于图1，与靶核酸分子的5'-端连接的茎-环适体的3'-端被保护免于降解，因为 其在得到的连接产物中缺少可裂解碱基，诸如dU。在酶促裂解和连接后，适体的剩余3'-端 可以充当后续扩增或其他核酸操作的引物结合位点。相反，在酶促裂解后适体二聚体和未 连接的适体被降解使得它们不能有效地被扩增并且不能参与到多种核酸操作中。
[0041] I.定义
[0042] 如本文所用的"扩增"指的是用于使一个或者多个核苷酸序列的拷贝数增加的任 何体外过程。核酸扩增使得核苷酸被掺入到DNA或RNA中。如本文所用，一个扩增反应可以由 多轮DNA复制组成。举例来说，一个PCR反应可以由30-100个变性和复制"循环"组成。
[0043] 如本文所用的"核苷酸"是本领域中指代碱基-糖-磷酸酯组合的术语。核苷酸是核 酸聚合物、即DNA和RNA的单体单元。该术语包括核糖核苷酸三磷酸，如rATP、rCTP、rGTPS rUTP;以及脱氧核糖核苷酸三磷酸，如dATP、dCTP、dUTP、dGTP或dTTP。
[0044] "核苷"是碱基-糖组合，即缺少磷酸酯的核苷酸。在本领域中应当认识到，在术语 核苷和核苷酸的使用中存在一定的可互换性。举例来说，核苷酸脱氧尿苷三磷酸dUTP是脱 氧核糖核苷三磷酸。在被掺入到DNA中之后，它用作DNA单体，在形式上是脱氧尿苷酸，即 dUMP或脱氧尿苷单磷酸。可以说是将dUTP掺入到DNA中，即使在所得的DNA中不存在dUTP部 分。类似地，可以说是将脱氧尿苷掺入到DNA中，即使那只是底物分子的一部分。
[0045] 如本文所用的"掺入"意指变成核酸聚合物的一部分。
[0046] 如本文所用的"寡核苷酸"共同地并且可互换地指的是本领域的两个术语，8卩"寡 核苷酸"和"多核苷酸"。应当指出的是，尽管寡核苷酸和多核苷酸是本领域的不同术语，但 它们之间不存在确切的分界线并且它们在本文中可互换使用。术语"适体"也可以与术语 "寡核苷酸"和"多核苷酸"互换使用。
[0047]如本文所用的"引物"指的是在扩增期间通过共价添加核苷酸单体而延伸的单链 寡核苷酸或单链多核苷酸。通常，核酸扩增是基于通过核酸聚合酶进行的核酸合成。许多这 样的聚合酶需要可以被延伸以开始核酸合成的引物的存在。
[0048] 如本文所用的术语"发夹"和"莖-环寡核苷酸"指的是由包含5 '末端区域和3 '末端 区域以及非自身互补的中央区域的寡核苷酸形成的结构，所述5'末端区域和3'末端区域是 形成双链茎的反向重复序列，所述非自身互补的中央区域形成单链环。
[0049] 如本文所用的术语"在没有外来操作的条件下"指的是存在对DNA分子的修饰而不 改变在其中修饰DNA分子的溶液。在具体实施方案中，这种情况在没有人手动操作的条件下 或在没有改变溶液条件的机器的条件下发生，所述溶液条件也可以称作缓冲液条件。然而， 在修饰期间可以发生温度改变。
[0050] II.可裂解碱基
[0051] 如本文所用的"可裂解碱基"指的是通常不存在于DNA的序列中的核苷酸。对于大 多数DNA样品，脱氧尿苷是可裂解碱基的实例。尽管脱氧尿苷的三磷酸形式dUTP作为代谢中 间体存在于活生物体中，但其很少被掺入到DNA中。当dUTP被掺入到DNA中时，所得的脱氧尿 苷在体内通过正常的过程被迅速去除，例如，涉及酶尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)的过程(美 国专利号4,873，192;0皿(^11，1981;两篇文献整体地通过引用并入本文）。因此，脱氧尿苷很 少或从未出现在天然DNA中。其他可裂解碱基的非限制性实例包括脱氧肌苷、溴脱氧尿苷、 7-甲基鸟嘌呤、5，6_二氢-5，6_二羟基脱氧胸苷、3-甲基脱氧腺苷等(参见，Duncan，1981)。 其他可裂解碱基对于本领域技术人员将是显而易见的。
[0052] III.DNA 糖基化酶
[0053]术语"DNA糖基化酶"指的是具有糖基化酶活性的任何酶，所述糖基化酶活性导致 核苷酸的被修饰的含氮杂环成分从多核苷酸分子中被切除，从而形成脱碱基位点。
[0054]如在本文中所用，术语"脱碱基DNA"或"具有脱碱基位点的DNA"指的是含有至少一 个脱碱基核苷酸(有时称作"脱碱基位点"）的单链或双链DNA分子。"脱碱基核苷酸"是在脱 氧核糖的Γ位中缺少碱基的核苷酸。
[0055] DNA N-糖基化酶包括下列的酶以及它们在高级真核细胞中的同系物，包括人同系 物:尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)和3-甲基腺嘌呤DNA糖基化酶II (例如，AlkA) (Nakabeppu等， 1984; Varshney等，1988; Varshney等，1991)。另外的DNA N-糖基化酶包括TagI糖基化酶和 MUG糖基化酶（Sakumi等，1986; Barrett等，1998)。
[0056] 尿嘧啶DNA糖基化酶识别存在于单链或双链DNA中的尿嘧啶并且裂解DNA糖-磷酸 酯主链的尿嘧啶碱基和脱氧核糖之间的N-糖苷键，留下脱碱基位点。参见例如美国专利号 6，713，294。尿嘧啶的去除在DNA中形成了脱嘧啶位点。然而，酶没有裂解DNA分子的磷酸二 酯主链。
[0057] 缩写为"UDG"或"UNG"的尿嘧啶-DNA糖基化酶包括线粒体UNG1、核UNG2、SMUG1 (单 链选择性尿嘧啶-DNA糖基化酶）、TDG (TU错配DNA糖基化酶）、MBD4 (具有甲基结合结构域的 尿嘧啶-DNA糖基化酶)和其他真核和原核的酶(参见Krokan等，2002)。拥有此活性的酶不作 用于游离dUTP、游离脱氧尿苷或RNA(Duncan, 1981)。
[0058]用于形成一个或多个脱碱基位点的UDG酶的另一个实例是来自闪烁古生球菌 (Archaeoglobus fulgidus)的大肠杆菌UDG的热稳定同源物。Afu UDG催化游离尿啼啶从含 尿嘧啶的DNA中释放。Afu UDG有效地从单链或双链DNA水解尿嘧啶。另一个实例包括南极热 不稳定的UDG，其催化游离尿嘧啶从含尿嘧啶的单链或双链DNA释放。南极热不稳定的UDG酶 对热敏感并且可以在高于50°C的温度下快速和完全地失活。
[0059]另外的可裂解碱基的非限制性实例和它们各自的切口剂(nicking agent)如下： AlkA糖基化酶识别并裂解脱氧肌苷残基;DNA-7-甲基鸟嘌呤糖基化酶识别并裂解7-甲基鸟 嘌呤残基;次黄嘌呤-NDA糖基化酶识别并裂解次黄嘌呤残基;3-甲基腺嘌呤-DNA糖基化酶I (例如，TagI)和3-甲基腺嘌呤-DNA糖基化酶II (例如，AlkA)识别并裂解3-甲基腺嘌呤残基； Fpg识别并裂解8-氧代-鸟嘌呤残基；以及Mug从DNA识别并裂解3，N(4)_乙烯胞嘧啶 (ethenocytosine)和尿啼啶残基。
[0060] IV.脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶
[0061 ]如在本文中所用，术语"AP核酸内切酶"或"AP裂解酶"意指能够在脱碱基位点处破 坏核酸的磷酸二酯主链的酶。该术语包括能够破坏脱碱基位点的5'和3'两者处的主链的 酶。
[0062] 在例如UDG裂解糖苷键后保留的DNA糖-磷酸酯主链然后可以例如通过碱解、高温、 在碱性残基之间包含芳香残基的三肽诸如Lys-Trp-Lys和Lys-Tyr-Lys(Pierre等，1981; Doetsch等，1990)、和AP核酸内切酶诸如核酸内切酶IV、核酸内切酶V、核酸内切酶III、核酸 内切酶VI、核酸内切酶VII、人核酸内切酶II等裂解。因此，诸如APE I的酶可以与UDG结合使 用以从核酸分子去除dU残基，然后在核酸分子上形成切口。
[0063]用于在脱碱基位点处形成切口的酶的实例包括脱嘌呤/脱嘧啶(AP)核酸内切酶诸 如APE 1(还称为HAP 1或Ref-Ι)，其与大肠杆菌核酸外切酶III蛋白具有同源性。APE 1紧靠 AP位点的5'经由水解机制裂解磷酸二酯主链以产生单链DNA碎片，留下3'-羟基和5'-脱氧 核糖磷酸末端。
[0064] 人工切口剂可以通过将DNA N-糖基化酶与AP核酸内切酶组合，例如通过将UDG糖 基化酶与APE I核酸内切酶组合或将AlkA糖基化酶与EndoIV核酸内切酶组合以实现在修饰 的核苷酸处的单链裂解来形成。
[0065]在本发明的某些实施方案中，可以将不同类型的被修饰的核苷酸在多个所选的位 置处引入以便在两个或更多个位置处顺序地切开一个或多个靶分子。例如，可以将脱氧尿 苷、8-氧代-鸟嘌呤和脱氧肌苷引入到一个或多个靶分子的选定位置中。可以配制单一切口 剂，该单一切口剂根据掺入的被修饰核苷酸包含多于一种的特异性组分。或者，可以配制分 开的多种切口剂并将其顺序地应用于一个或多个靶分子。例如，AlkA和FPG糖基化酶/AP裂 解酶选择性地在脱氧肌苷和脱氧8-氧代-鸟嘌呤处做切口，它们可以组合或与含有选择性 地在脱氧尿苷处做切口的UDG和EndoVII I糖基化酶/AP裂解酶的切口剂一起顺序使用。 [0066]本文所述的能够切除修饰的核苷酸的切口剂的实例包括：用于切除脱氧尿苷-UDG 糖基化酶与EndoIV核酸内切酶的混合物;UDG糖基化酶与FPG糖基化酶/AP裂解酶的混合物； UDG糖基化酶与EndoVII I糖基化酶/AP裂解酶的混合物;含有UDG糖基化酶、EndoIV核酸内切 酶和EndoVIII糖基化酶/AP裂解酶的混合物；用于切除8-氧代-鸟嘌呤和脱氧尿苷-含有UDG 糖基化酶、FPG糖基化酶/AP裂解酶和EndoIV核酸内切酶的混合物，或UDG糖基化酶与FPG糖 基化酶/AP裂解酶的混合物；以及用于切除脱氧肌苷-AlkA糖基化酶与EndoVIII糖基化酶/ AP裂解酶的混合物，或AlkA糖基化酶与FPG糖基化酶/AP裂解酶的混合物。
[0067]来自大肠杆菌的核酸内切酶VIII充当N-糖基化酶和AP-裂解酶两者。N-糖基化酶 活性从双链DNA释放降解的嘧啶，生成AP位点。AP-裂解酶活性裂解AP位点的3 '侧，留下5 '磷 酸酯和3'磷酸酯。由核酸内切酶VIII识别和去除的降解的碱基包括尿素、5,6_二羟基胸腺 嘧啶、胸腺嘧啶二醇、5-羟基-5-甲基海因、尿嘧啶二醇、6-羟基-5，6_二氢胸腺嘧啶和丙醇 二酰脲(methyltartronylurea)。尽管核酸内切酶VIII类似于核酸内切酶III，但是核酸内 切酶VIII具有β和δ裂解酶活性，而核酸内切酶III具有β裂解酶活性。
[0068] Fpg(甲酰胺基嘧啶[fapy]_DNA糖基化酶）（还称为8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶)充 当N-糖基化酶和AP裂解酶两者。N-糖基化酶活性从双链DNA释放降解的嘌呤，产生脱嘌呤 (AP)位点。AP裂解酶活性裂解AP位点的3 '侧和5 '侧两者，从而去除AP位点且留下一个碱基 的缺口。被Fpg识别且去除的一些降解的碱基包括7，8_二氢-8-氧代鸟嘌呤（8-氧代鸟嘌 呤）、8_氧代腺噪呤、fapy-鸟噪呤、甲基-fapy-鸟噪呤、fapy-腺噪呤、黄曲霉素 Bl-fapy-鸟 嘌呤、5-羟基-胞嘧啶和5-羟基-尿嘧啶。
[0069] 还考虑的是称作USER?酶和USER?酶2的切口剂，USER?酶特异性地在脱氧尿苷处 切开靶分子，USER?酶2特异性地在脱氧尿苷和8-氧代-鸟嘌呤两处切开靶分子，在切口位置 处留下5 '磷酸酯(参见美国专利号7，435，572) WSER?酶是尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)和DNA 糖基化酶-裂解酶核酸内切酶VIII的混合物。UDG催化对尿嘧啶碱基的切除，形成脱碱基(脱 嘧啶)位点，同时保持磷酸二酯主链完整。核酸内切酶VIII的裂解酶活性在脱碱基位点的3 ' 侧和5'侧处使磷酸二酯主链断裂，因此释放不含碱基的脱氧核糖。
[0070] V.核酸外切酶
[0071] 用于在切口位点处降解核酸的酶的实例包括多种核酸外切酶，诸如核酸外切酶I (Exo I)和核酸外切酶IlKExo IIIhExo I(大肠杆菌)催化从单链DNA以3'至5'的方向去 除核苷酸。例如，Exo I可以在包含双链核酸产物的反应混合物中降解单链寡核苷酸。Exo ΙΙΙ(大肠杆菌)催化从双链体DNA的3'-羟基末端逐步去除单核苷酸。在每个结合事件期间 去除有限数目的核苷酸，从而在DNA分子的群体内形成协同的进行性缺失。优选的底物是平 的或凹陷的3 '末端，尽管所述酶还在双链体DNA中的切口处起作用以产生单链缺口。λ核酸 外切酶可以用来以5'至3'的方向在切开的位点处酶促降解核酸。
[0072] VI.适体和它们用于DNA加工的用途
[0073]用另外的短的多核苷酸序列(称为适体或接头)补充DNA末端在分子生物学的许多 领域中使用。做过适应性改动的DNA分子的有用性通过但不限于几个实例来说明，所述实例 诸如由连接介导的位点特异性PCR、由连接介导的全基因组扩增、由适体介导的DNA克隆、 DNA亲和标签、DNA标记等。
[0074] Α.已知DNA序列侧翼的未知区域的由连接介导的扩增
[0075]通过DNA碎片化和向一个或两个DNA末端添加通用适体产生的文库用来扩增(通过 PCR)和测序与以前建立的DNA序列邻接的DNA区域(参见例如美国专利号6,777，187和其中 的参考文献，它们全部整体地通过引用并入本文）。适体可以连接到DNA的5'端、3'端或两条 链。适体可以具有3'或5'突出物。它也可以具有平端，尤其是在DNA末端在酶促、机械或化学 DNA碎片化后被"抛光"的情况下。由连接介导的PCR扩增通过使用位点特异性引物(或几种 巢式引物)和与适体序列互补的通用引物来实现。
[0076] Β.由连接介导的全基因组扩增
[0077]将通过DNA碎片化和后续将通用适体连接到两个DNA末端生成的文库用来扩增全 基因组DNA(全基因组扩增，或WGA)(参见例如美国专利公开号2004/0209299和美国专利号 7,718,403和其中的参考文献，它们全部整体地通过引用并入本文）。适体可以连接至0~八的 两条链或仅连接到3 '端接着进行延伸。适体可以具有3 '或5 '突出物，这取决于通过限制性 酶或用来消化DNA的其他酶所产生的DNA末端的结构。其还可以具有平端，诸如在DNA末端在 酶促DNA裂解后是平端的情况下或当在酶促、机械或化学DNA碎片化后所述末端被修复和 "抛光"时。在具体实施方案中，通过使用与一个或多个适体序列互补的一个或两个通用引 物来完成全基因组PCR扩增。
[0078] C.由适体介导的DNA克隆
[0079] 适体(或接头)常常用于DNA克隆（参见例如Sambrook等，1989)。将双链适体连接到 通过超声作用、雾化或水力剪切(hydro-shearing)过程产生的DNA片段，接着在适体内进行 限制性消化，能够产生具有3 '或5 '突出末端的DNA片段，所述具有3 '或5 '突出末端的DNA片 段可以有效地被引入到载体序列中并进行克隆。
[0080] VII.实施例
[0081] 包括下列实施例以说明本发明的优选的实施方案。本领域技术人员应当了解的 是，随后的实施例中所公开的技术代表了本申请的发明人所发现的在实施本发明中运行良 好的技术，并且因此可以被认为构成了用于实施本发明的优选方式。然而，本领域技术人员 根据本公开应当了解的是，可以在所公开的具体实施方案中作出许多变化并且这些变化仍 获得同样的或类似的结果而不背离本发明的精神和范围。
[0082] 实施例1 -用于减少背景的可降解适体-热降解
[0083] 下面的实施例说明了在未连接的链中使用包含可降解的脱碱基位点（dU)的可降 解适体从而允许使用热诱导的降解将游离的适体和适体二聚体降解成小的寡核苷酸。 [0084] 模板制备.将10微升的每一种DNA样品（200pg的经过Covaris剪切的人类gDNA)添 加到PCR板孔中。对于非模板对照(NTC)，以10yL无核酸酶的水代替DNA样品。在单独的管中 制备补充有dNTP混合物(每一种dNTP 2.5mM))的2μ!7样品的模板制备缓冲液（（包含以下各 项的6.5Χ无 ΑΤΡ连接酶缓冲液：325mM Tris-HCl(pH 7.6,在25°C)、65mM MgCl2、3.25mM DTT)和lyL/样品的模板制备酶（末端修复混合物(End Repair Mix)，Enzymatics目录号 Y914-LC-L)的预混物，并且通过移液管混合。然后，将3yL的预混物添加到PCR管或孔中的10 yL的DNA样品中并且使用被设定为8yL的移液管混合4-5次。反应组分的最终浓度如下：50mM Tris-HCl(pH 7.6,在25°C)、10mM MgCl2、0.5mM DTT、385yM dNTP、lX末端修复酶。将PCR板 离心并且在热循环仪中使用下列条件孵育：在22°C进行1个循环25分钟；在55°C进行1个循 环20分钟;保持在22 °C。
[0085] 文库合成.在单独的管中制备1μ!7样品的文库合成缓冲液(包含以下各项的2 X无 ΑΤΡ连接酶缓冲液：100mM Tris-HCl(pH 7.6,在25°C)、20mM MgCl2、1.0mM DTT，补充有 15mM ATP和15μΜ每一种茎-环适体寡核苷酸-表1 ;SEQ ID N0:5和6)和1μ!7样品的文库合成酶混 合物(每yL包含：1.2U的尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG，Enzymatics目录号G5010L)和8U T4DNA连 接酶(Enzymatics目录号L603-HC-L))的新鲜文库合成预混物，并且通过移液管混合。然后， 将2yL的文库合成预混物添加到每一种样品中并且使用被设定为10yL的移液管混合4-5次。 反应组分的最终浓度如下：50mM Tris-HCl(pH 7.6,在25°C)、10mM MgCl2、0.5mM DTT、334y M dNTP、lmM ATP、1.2U尿嘧啶DNA糖基化酶、8U T4DNA连接酶、ΙμΜ每一种适体寡核苷酸。将 板离心并且在热循环仪中使用下列条件孵育:在22°C进行1个循环40分钟;保持在4°C。
[0086] ThruPLEX-FD文库扩增.在临用前在单独的管中制备4.25μ!7样品的无核酸酶的 水、3.75yL/样品的EvaGreen?:焚光素(FC; 9:1)和50.5yL/样品的文库扩增缓冲液(包含： 150mM Tris-S〇4(pH 8.5,在25°C)、120mM TMAC、0.75mM MgCl2、0.06%w/v明胶，补充有 0.375μΜ的每一种PCR寡核苷酸-表1;SEQ ID N0:7和8)的文库扩增预混物。
[0087]对于在添加聚合酶后要加热的样品，将1.5μ!7样品的文库扩增酶(ΚΑΡΑ HiFi? DNA聚合酶(ΚΚ2102)，?υ/μ1)添加到预混物中。然后，将60yL的文库扩增预混物添加到每一 种文库中并且使用被设定为60yL的移液管混合3-4次。
[0088]对于在添加聚合酶之前要加热的样品，将58.5μ!7样品的不含ΚΑΡΑ HiFi? DNA聚 合酶的文库扩增预混物添加到每一种文库中并且使用被设定为60yL的移液管混合3-4次。 将样品在85°C加热5min，然后将1.5yL文库扩增酶(ΚΑΡΑ HiFi? DNA聚合酶(ΚΚ2102)，?υ/μ L)添加到每种样品中。
[0089] 对于所有反应，反应组分的最终浓度如下：100mM Tris-S〇4(pH 8.5,在25°C)、 80mM TMAC、2 · 5mM MgCl2、0 · 04%w/v明胶、1 xEv效Gfeen?荧光报告染料、1 X 校准染料（荧 光素）、1.5U ΚΑΡΑ HiFi? DNA聚合酶、0.25μΜ每一种PCR寡核苷酸。将板离心，然后如下在实 时热循环仪中孵育：在72°C进行1个循环3分钟；在85°C进行1个循环2分钟；在98°C进行1个 循环2分钟；在98°C持续20秒、在67°C持续20秒、在72°C持续40秒的4个循环；以及在98°C持 续20秒和在72°C持续50秒的4-21个循环。
[0090] 结论.对适体和适体二聚体的热降解导致约6.5个循环（100倍)右移和提高的信噪 比（图3)。
[0091] 实施例2-用于减少背景的可降解适体-酶促降解
[0092] 下面的实施例说明了在本发明的可降解适体技术中使用的组合酶活性之间的令 人惊讶的、出人意料的和协同的效应，即，尿嘧啶-DNA糖基化酶、脱嘌呤/脱嘧啶(AP)核酸内 切酶和核酸外切酶的协同活性。
[0093]将来自健康供体的汇集的人淋巴细胞DNA在TE缓冲液中稀释到23.8pgAiL并且接 受同时的碎片化和末端修复。将10微升等分试样的含有稀释DNA或非模板对照(NTC)的TE缓 冲液补充以包含20mM Tris-HCl、50mM NaCl、10mM MgCl2、0.15%Trit〇n?X-100(pH 7.5， 在25°C)的NEBNext? dsl)V\ Fragmentase?反应缓冲液，在13yL的最终体积中含有lyL H'EB.NesxtdidsD'sAFragnientase? (New England Biolabs，目录号M0348S)和0.5yL末端修 复混合物(End-Repair Mix) (Enzymatics目录号Y9140-LC-L)。将样品在22°C孵育30分钟， 接着在55 °C孵育20分钟，在22 °C孵育2分钟。
[0094]下一步，将每种最终浓度为ΙμΜ的茎-环寡核苷酸适体（表1，SEQ ID NO: 1和2)、 240U T4DNA连接酶(Enzymatics 目录号L6030-HC)和6U尿啼啶-DNA糖基化酶(Enzymatics 目 录号G5010L)的混合物添加到每种样品中达到15yL的最终体积，并且将样品在22°C孵育40 分钟，接着在55 °C孵育15分钟并在37 °C孵育2分钟。
[0095]为了测试游离适体分子和适体二聚体的降解，将15U人脱嘌呤/脱嘧啶(AP)核酸内 切酶、APE l(New England Biolabs 目录号M0282S)或 10U大肠杆菌ExoI(New England Biolabs目录号M0293S)添加到含DNA的样品中或添加到NTC对照中，并在37°C孵育15分钟， 在42°C孵育3分钟，在45°C孵育3分钟，和在55°C孵育10分钟。包含APE 1和Exo I两者的对照 也平行地运行以便探究核酸酶的潜在协同效应。
[0096] 为了扩增文库，将60yL包含1XKAPA HiFi? DNA聚合酶保真缓冲液、1.5U ΚΑΡΑ HiFi? DNA 聚合酶（ΚΑΡΑ Biosystems 目录号 ΚΚ2101)、lx EvaGreen? 荧光报告染料 (Biotium，Inc.目录号31000)、1 X校准染料（荧光素）、0.3mM dNTP混合物和0.35μΜ每种PCR 引物的PCR主混合物(master mix)(表1，SEQ ID N0:3和4)添加到所有样品和NTC对照中。使 用BioRad iCycler?实时PCR仪器按下面的循环规程进行扩增:在72°C进行1个循环3分钟； 在85 °C进行1个循环2分钟;在98 °C进行1个循环2分钟;在98 °C持续20秒、在65 °C持续20秒和 在72°C持续40秒的4个循环；以及在98°C持续20秒和在72°C持续50秒的25个循环。在最后25 个循环的72 °C延伸步骤时获取实时数据。
[0097]如图2A中所示，APE 1和Exo I的同时存在导致了由适体二聚体引起的背景的超过 5个循环的右移(减少>32倍），而没有任何单个核酸酶能够显著地降解由两个适体分子彼此 连接而形成的二聚体（图2B和2C)。
[0098]表1.寡核苷酸序列。
[0099]
[0100] 氺氺氺
[0101] 根据本公开可以进行并且完成本文所公开并且要求保护的所有方法而无需过多 的实验。虽然已经关于优选的实施方案对本发明的组合物和方法进行描述，但对于本领域 技术人员来说将显而易见的是，在不脱离本发明的构思、精神以及范围的前提下，变化可以 被应用到本文所述的方法以及本文所述的方法的步骤或步骤序列中。更确切地说，将显而 易见的是，在化学和生理学这两方面相关的某些试剂可以代替本文所述的试剂，而仍将实 现相同或类似的结果。所有这些对于本领域技术人员来说显而易见的类似的替代和改动均 被认为落入如由所附权利要求书所限定的本发明的精神、范围以及构思内。
[0102] 参考文献
[0103] 下列参考文献就它们提供了补充本文所阐述内容的示例性程序或其他细节来说 明确地以引用的方式并入本文。
[0104] 美国专利号4,873,192
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【主权项】
1. 一种加工具有至少一个可裂解碱基的核酸的方法，包括： (a) 在所述至少一个可裂解碱基处形成脱碱基位点； (b) 在所述核酸的主链中在所述脱碱基位点处形成切口；和 (c) 去除邻接所述切口的至少一个核苷酸。2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸包含可降解适体。3. 根据权利要求2所述的方法，其中所述可降解适体是部分双链的寡核苷酸适体、双链 的寡核苷酸适体、或茎-环寡核苷酸适体。4. 根据权利要求3所述的方法，其中所述茎-环寡核苷酸适体包含： (a) 包含至少一个可裂解碱基的5'片段； (b) 与所述5 '片段的3 端偶联的中间片段;和 (c) 与所述中间片段的3'-端偶联的3'片段， 其中所述5 '片段和3 '片段是至少80 %互补的。5. 根据权利要求4所述的方法，其中所述3 '片段不包含可裂解碱基。6. 根据权利要求4所述的方法，其中所述中间片段包含至少一个可裂解碱基。7. 根据权利要求4所述的方法，其中所述茎-环寡核苷酸适体的所述5 '片段和所述中间 片段每3-6个碱基包含一个可裂解碱基。8. 根据权利要求1和4-7中任一项所述的方法，其中所述可裂解碱基是脱氧尿苷。9. 根据权利要求1所述的方法，其中在所述至少一个可裂解碱基处形成脱碱基位点包 括用尿嘧啶-DNA糖基化酶处理所述具有至少一个可裂解碱基的核酸。10. 根据权利要求1所述的方法，其中在所述脱碱基位点处形成切口包括用脱嘌呤/脱 嘧啶核酸内切酶处理步骤(a)的核酸。11. 根据权利要求1所述的方法，其中去除邻接所述切口的至少一个核苷酸包括用核酸 外切酶处理步骤(b)的核酸。12. 根据权利要求10所述的方法，其中所述脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶是APE 1。13. 根据权利要求11所述的方法，其中所述核酸外切酶是核酸外切酶I。14. 一种制备核酸分子的方法，包括： (a) 提供双链核酸分子； (b) 将包含至少一个可裂解碱基的可降解适体的3'端连接至所述双链核酸分子的5'端 以产生附接了寡核苷酸的核酸分子； (c) 在所述至少一个可裂解碱基处形成脱碱基位点； (d) 在所述脱碱基位点处形成切口；和 (e) 去除邻接所述切口的至少一个核苷酸。15. 根据权利要求14所述的方法，其中所述可降解适体是部分双链的寡核苷酸适体、双 链的寡核苷酸适体或茎-环寡核苷酸适体。16. 根据权利要求15所述的方法，其中所述茎-环寡核苷酸适体包含： (i)包含至少一个可裂解碱基的5 '片段； (i i)与所述5 '片段的3 ' -端偶联的中间片段;和 (i i i)与所述中间片段的3 ' -端偶联的3 '片段， 其中所述5 '片段和所述3 '片段是至少80 %互补的。17. 根据权利要求16所述的方法，其中所述3 '片段不包含可裂解碱基。18. 根据权利要求15所述的方法，其中所述中间片段包含至少一个可裂解碱基。19. 根据权利要求18所述的方法，其中所述茎-环寡核苷酸适体的所述5'片段和所述中 间片段每3-6个碱基包含一个可裂解碱基。20. 根据权利要求14和16-19中任一项所述的方法，其中所述可裂解碱基是脱氧尿苷。21. 根据权利要求14所述的方法，其中所述连接在所述附接了寡核苷酸的核酸分子中 产生切口。22. 根据权利要求14所述的方法，其中所述双链核酸分子是双链DNA分子。23. 根据权利要求14所述的方法，进一步包括扩增所述附接了寡核苷酸的核酸分子的 至少一部分。24. 根据权利要求23所述的方法，其中所述扩增包括聚合酶链式反应。25. 根据权利要求16所述的方法，其中所述茎-环寡核苷酸包含已知序列。26. 根据权利要求14所述的方法，其中所述附接了寡核苷酸的核酸分子被进一步修饰。27. 根据权利要求26所述的方法，其中所述进一步修饰包括克隆。28. 根据权利要求27所述的方法，其中克隆被进一步限定为包括将被修饰的分子掺入 载体中，所述掺入发生于所述被修饰的分子的末端，所述被修饰的分子是通过在反向重复 序列内的核酸内切酶裂解生成的。29. 根据权利要求14所述的方法，其中所述方法进一步被限定为在单一合适的溶液中 进行，其中所述过程在没有外来操作的条件下进行。30. 根据权利要求14所述的方法，其中所述方法的步骤顺序地进行。31. 根据权利要求29所述的方法，其中所述溶液包含下列各项中的一种或多种：连接 酶、尿嘧啶-DNA糖基化酶、脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶、核酸外切酶、ATP和dNTP。32. 根据权利要求14所述的方法，其中所述附接了寡核苷酸的核酸分子被固定化在固 相载体上。33. 根据权利要求32所述的方法，其中所述分子被非共价地固定化。34. -种试剂盒，包含： (a) 包含至少一个可裂解碱基的核酸； (b) 尿嘧啶-DNA糖基化酶； (c) 脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶;和 (d) 核酸外切酶。35. 根据权利要求34所述的试剂盒，其中所述核酸包含可降解适体。36. 根据权利要求35所述的试剂盒，其中所述可降解适体是部分双链的寡核苷酸适体、 双链的寡核苷酸适体、或茎-环寡核苷酸适体。37. 根据权利要求36所述的试剂盒，其中所述茎-环寡核苷酸适体包含： (a) 包含至少一个可裂解碱基的5'片段； (b) 与所述5 '片段的3 端偶联的中间片段;和 (c) 与所述中间片段的3'-端偶联的3'片段， 其中所述5 '片段和3 '片段是至少80 %互补的。38. 根据权利要求37所述的试剂盒，其中所述3 '片段不包含可裂解碱基。39. 根据权利要求37所述的试剂盒，其中所述中间片段包含至少一个可裂解碱基。40. 根据权利要求39所述的试剂盒，其中所述茎-环寡核苷酸适体的所述5 '片段和所述 中间片段每3-6个碱基包含一个可裂解碱基。41. 根据权利要求34和37-40中任一项所述的试剂盒，其中所述可裂解碱基是脱氧尿 苷。42. 根据权利要求34所述的试剂盒，其中所述脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶是APE 1。43. 根据权利要求34所述的试剂盒，其中所述核酸外切酶是核酸外切酶I。
【文档编号】C12Q1/68GK105917002SQ201480073244
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2014年11月18日
【发明人】E·卡姆贝罗, J·朗格莫尔, T·泰斯默
【申请人】鲁比康基因组学公司