一种抗病毒抗病菌取代抗生素的禽畜肠道生态修复菌剂及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种抗病毒抗病菌取代抗生素的禽畜肠道生态修复菌剂及其制备方法，由酿酒酵母、产朊假丝酵母2株酵母和枯草芽孢杆菌、地衣芽胞杆菌及沼泽红假单胞菌3株细菌以及植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌2株乳酸菌等七种菌混合组成。各菌种分别单独接种于相应的灭菌培养基中进行活化、制备一级种子液，在二级、三级发酵时按照相近与共生的原则，将2株酵母混合发酵，3株细菌混合发酵，2株乳酸菌混合发酵，再将三者混合扩大培养菌液按1:1:1等体积混合后吸附于灭菌麦麸?米糠上，再经过固体发酵、低温干燥而制得固体菌剂。本发明的修复菌剂具有高密度、高活性的优良特性，并且首次提出益生菌菌剂与柠檬、黄芪水提液相复合。具有用量小，使用方法简便的突出特点。
【专利说明】-种抗病毒抗病菌取代抗生素的禽畜肠道生态修复菌剂及其 制备方法 所属技术领域
[0001] 本发明属于微生物发酵技术，特别是一种抗病毒抗病菌取代抗生素的禽畜肠道生 态修复菌剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 长期W来，在禽畜养殖业中大量甚至滥用抗生素，不仅使病原微生物产生了抗性， 而且严重破坏了禽畜肠道菌群的生态平衡，使禽畜出现免疫抑制，免疫力低下，抗病能力减 弱，因此使得病毒性及细菌性感染增多。每年的春、秋季多发性禽流感就是明证。而且，面对 病毒性感冒和病毒性肠道疾病，除了个别的可W通过打疫苗预防外，面对不断变异的病毒 感染，几乎是束手无策，只能是看着大片的鸡群、大量的猪群死亡。另外，大量使用抗生素不 仅会在禽畜产品中残留，而且会造成区域性±壤、水域的污染，直接威胁到人类的生命健 康。2013年中国抗生素使用一年达16.2万吨，约占世界用量的一半，其中52%为兽用，48% 为人用，超过5万吨抗生素被排放进入水±环境中。复旦大学王和兴等，对2013年采集到的 上海地区的586名8至11岁学龄儿童尿样进行研究，其中79.6%的学龄儿童尿液中检出21种 抗生素中的一种或几种。所W，禁止在禽畜饲料中添加抗生素是自然法则。经济发达的美 国、欧盟等国，早在上个世纪末就发出禁令。我国也在逐步减少或禁止在饲料中添加抗生 素。因此，为了发展禽畜生态养殖业，必须寻找能替代抗生素的制剂，用于禽畜的防病治病。 目前，国内外研究主要集中于在益生菌、益生元、免疫增强剂、中草药制剂、酶制剂等领域。
【发明内容】
[0003] 本发明目的在于针对上述存在问题，提供一种高密度、高活性的抗病毒抗病菌取 代抗生素的禽畜肠道生态修复菌剂及其制备方法。
[0004] 为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种抗病毒抗病菌取代抗生 素的禽畜肠道生态修复菌剂，包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ACCC20037、产航 假丝酵母(Candida utilis)ACCC20060、枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)ACCC10114,地 衣芽抱杆菌（Bacillus 1;[。11日]11的1'11113)4〔〔〔10146、沼泽红假单胞菌（加〇(1〇93日11(1〇111〇]1日8 palust;ris)ACCC10649、植物乳杆菌化actobacillusplanta;rum)ACCC10141和鼠李糖乳杆 |if(Lactobacillus rhamnosus)ACCC10534。
[0005] 还包括巧樣、黄巧的水提物。
[0006] 所述的修复菌剂的有效活性菌总菌落数2.〇-3.0*1〇1<^〔。11/肖，其中酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae )ACCC20037和产航假丝酵母(Candida util is )ACCC20060 为 0.5-0.6*l〇iDCFU/g，枯草芽抱杆菌（Bacillus subtil is )ACCC10114+地衣芽抱杆菌 (Bacillus licheniformis)ACCC10146+沼泽红假单胞菌（lihodopseudomonas palustris) ACCC10649为0.5-0.6*l〇i°CFU/g，植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum)ACCC10141+鼠李 糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus)ACCC10534为 1.0-1.8*l〇i日CFU/g。
[0007] 所述抗病毒抗病菌取代抗生素的禽畜肠道生态修复菌剂的制备方法，将各菌种分 别单独活化，接种于相应的灭菌培养基中进行一级种子液扩大培养，在二级、Ξ级发酵时按 照相近与共生的原则，将2株酵母混合发酵，3株细菌混合发酵，2株乳酸菌混合发酵，再将Ξ 者混合扩大培养菌液按1:1:1等体积混合后吸附于灭菌麦教-米慷上，再经过固体发酵阶 段，最后低溫干燥，制得固体菌剂，具体步骤如下：
[0008] 1)将冰箱冷藏保存的各斜面菌种分别单独活化后，分别经摇瓶扩大培养制成一级 种子液；
[0009] 2)将上述各菌种的一级种子液分别在灭菌培养基内进行二级混合扩大培养制成 二级扩大培养液：
[0010] 产航假丝酵母与酿酒酵母的二级混合培养条件是:接种量各为5-lOwt%、溫度30 ± rc、揽拌速度200-25化/min、压力0.05MPa，培养时间20-24h，培养基配方，按质量百分 tt:酵母膏 1.0-1.5%，薦糖3.0-5.0%，蛋白腺 1.0-2.0%，牛肉膏0.5-1.0%，pH值7.2-7.4， 余量为水；
[0011] 枯草芽胞杆菌、地衣芽抱杆菌和沼泽红假单胞菌二级混合培养条件是:接种量各 为5-lOwt%、溫度37±rC、揽拌速度100-150r/min、压力0.05MPa，培养时间15-20h，培养基 配方，按质量百分比：牛肉膏1.0-1.5%，蛋白腺2-2.5%，酵母膏0.2-0.5%，薦糖0.5- 1.0%，氯化钢 1.0-1.5%，pH值7.0-7.2,余量为水；
[0012] 植物乳杆菌与鼠李糖乳杆菌的一级种子液在灭菌培养基内进行二级混合扩大培 养制成二级扩大培养液，培养条件是:接种量各为5-lOwt%，静止培养，50-l(K)r/min每小时 间歇揽拌2-5min，溫度控制30-37°C，培养时间20-24h，培养基制备：
[0013] a.鲜巧樣+黄巧粉的水提取液的制备:按质量份数，称取鲜巧樣10份，绞粹，与黄巧 粉10份加入到不诱钢提取锅内，加入100份水，加热至90-100°C浸煮30π?η，Ξ层纱布过滤， 浸煮2次，合并滤液，得到巧樣、黄巧水提取液；
[0014] b.按质量百分比：牛肉膏1.0-1.5%，蛋白腺1.0-1.5%，酵母膏0.5-0.8%，薦糖 3.0-3.5 %，醋酸钢0.5-1.0 %，憐酸氨二钟0.2-0.4 %，巧樣酸锭0.2-0.5 %，硫酸儀0 . Οδ? ?. 1 % ， 硫酸儘 0.005-0.01 % ， 碳酸巧 0.3-0. 5 % ， 吐溫-80:1 毫升/100 毫升 ，余量为步骤 a 中 制备的巧樣、黄巧水提取液，pH值6.2-6.4;
[0015] 3)将上述各菌的二级混合扩大培养液分别在灭菌培养基内进行Ξ级混合扩大培 养制成Ξ级扩大培养液：
[0016] 产航假丝酵母与酿酒酵母Ξ级混合扩大培养条件是:接种量5-lOwt%、溫度30±1 °C、pH值7.2-7.4、揽拌速度200-250r/min、压力0.05MPa，培养时间20-2地，培养基同二级；
[0017] 枯草芽胞杆菌、地衣芽抱杆菌和沼泽红假单胞菌Ξ级混合扩大培养条件是:接种 量5-lOwt%、溫度37± rC、pH值7.0-7.2、揽拌速度 150-200r/min、压力0.05MPa，培养时间 18-20h，培养基同二级；
[001引植物乳杆菌与鼠李糖乳杆菌Ξ级扩大培养:接种量5-lOwt%，静止培养，50-10化/ min每小时间歇揽拌2-5min，溫度控制30-37°C，培养时间20-24h，发酵终止时调整pH值 3.8-4.1W增加乳酸菌的稳定性，培养基同二级；
[0019] 4)将上述Ξ类混合菌的Ξ级扩大培养液，按1:1:1等体积混合均匀，得到菌剂混合 液；
[0020] 5)将上述菌剂混合液按照质量比0.5:1喷洒于灭菌麦教-米慷上，边喷洒边揽拌， 使菌液均匀地吸附、固化于麦教-米慷上，经过固体发酵、低溫干燥，最后制得固体菌剂；
[0021] 6)将制成的固体菌剂密封于内衬聚乙締膜的包装袋内，室溫保存，防潮、防暴晒。
[0022] 所述菌种活化方法是:把琼脂斜面保存的各菌菌种从冰箱冷藏室取出，放于超净 工作台内，在酒精灯火焰旁，分别转接于琼脂平板培养基上，在30-37 °C下培养20-3化后，平 板上生长出大大小小的菌落，再从平板上菌落中挑取单菌落转接于灭菌试管中的培养液 中。
[0023] 所述步骤1)中活化后的每个菌种单独扩大培养的培养基分别是：
[0024] 枯草芽胞杆菌、地衣芽抱杆菌与沼泽红假单胞菌的培养基为牛肉膏蛋白腺培养 基，按质量百分比：牛肉膏0.5-0.8%，蛋白腺1.0-1.5%，氯化钢0.5-0.8%，余量为水，pH值 7.0-7.2；
[0025] 酿酒酵母与产航假丝酵母的培养基为PDA,制备方法:按质量份数，取去皮马铃馨 200-250份，切成小块，加水1000份煮沸30min，Ξ层纱布过滤，滤液补足至1000份，加入20- 25份葡萄糖，溶化后115 °C灭菌30min;
[0026] 植物乳杆菌与鼠李糖乳杆菌的培养基为MRS,按质量百分比：牛肉膏1.0-1.5%，蛋 白腺1.0-1.5%，酵母膏0.5-0.8%，薦糖3.0-3.5%，醋酸钢0.5-0.8%，憐酸氨二钟0.2- 0.5 %，巧樣酸锭0.2-0.5 %，硫酸儀0.05-0.1 %，硫酸儘0.005-0.01 %，碳酸巧0.3-0.5 %， 吐溫-80每100毫升培养基加1毫升，余量为水，pH值6.2-6.4。
[0027] 所述步骤5)中在固体发酵罐内，控制含水率50-60%，30-40°C下发酵20-2地，再经 过低溫40-45°C干燥，控制菌剂含水率在8-10%，制得固体菌剂，固体菌剂有效活性菌总菌 落数> 2.0-3.0*l〇iDCFU/g，乳酸菌总菌落数> 1.0-1.8*l〇iDCFU/g，细菌总菌落数>0.5- 0.6*l〇i〇C 即/邑。
[0028] 本发明的有益效果是:该生态修复菌剂具有高密度、高活性的优良特性。该生态修 复菌剂可W直接添加到禽畜精饲料中，充分混合均匀。对于大棚养殖鸡(维鸡、肉鸡、蛋鸡） 推荐使用量:每只鸡每天0.05-0.1 g;对于养殖猪（乳猪、母猪、育肥猪）：每头猪每天2.0- 5.Og;对于奶牛或肉牛推荐用量:每头牛每天20-30g.具有用量小，使用方法简便突出特点。 取代所有抗生素，抗病毒抗病菌，修复调整禽畜肠道菌群结构，预防常见呼吸道及肠道疾 病，提高饲料报酬，降低料肉比，提高禽畜生产性能，经济效益显著。具有广阔的市场应用前 景，具有显著的生态效益和社会效益，对实现真正意义上的生态养殖具有重大意义。
【具体实施方式】
[0029] 本发明的抗病毒抗病菌取代抗生素的禽畜肠道生态修复菌剂，包括酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)ACCC20037，产航假丝酵母（Candida utilis)ACCC20060,枯 草芽抱杆菌（Bacillus subtil is )ACCC10114,地衣芽抱杆菌（Bacillus licheniformis) 八〔〔〔10146,沼泽红假单胞菌（拙〇(1〇93日11(1〇111〇]1日8 9日11131：1'13)4〔〔〔10649，植物乳杆菌 化actobacillus planta;rum)ACCC10141 和鼠李糖乳杆菌化actobacillus rhamnosus) ACCC10534等并与巧樣、黄巧水提液混合组成，其中植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌是主打菌， 巧樣、黄巧的水提液主成分是多糖。所有菌种均购于中国农业微生物菌种保藏管理中屯、 (ACCC)，也是农业部2045号公告（2013)允许在饲料添加剂中使用的益生菌菌种。巧樣购于 我国巧樣主产地-四川安岳县，黄巧购于黄巧主产地-安徽毫州。
[0030] -种抗病毒抗病菌取代抗生素的禽畜肠道生态修复菌剂的制备方法，将各菌种分 别接种于相应的灭菌培养基中进行活化、制备一级种子液，二级、Ξ级采用相近、共生的原 贝1J，把2株酵母、3株细菌、2株乳酸菌混合扩大培养，将经过Ξ级扩大培养菌液、混合、吸附于 灭菌麦教-米慷上，再经过固体发酵，最后低溫干燥制得固体菌剂。其中两株乳酸菌的二级、 Ξ级混合扩大培养液中含有巧樣+黄巧的水提取液。具体步骤如下：
[0031] 1)将冰箱冷藏保存的各斜面菌种活化后，分别单独经摇瓶扩大培养制成一级种子 液;所述活化后的每菌种一级种子液的培养基分别是:枯草芽胞杆菌、地衣芽抱杆菌与沼泽 红假单胞菌的培养基为牛肉膏蛋白腺培养基[配方(wt%):牛肉膏0.5-0.8%，蛋白腺1.Ο? ι. 5 % ， 氯化钢 0.5-0.8 % ， 余量水， pH值 7.0-7.2] 。酿酒酵母与产航假丝酵母的培养基为 PDA (制备方法:取去皮马铃馨200-250克，切成小块(片），加水1000毫升煮沸30min，Ξ层纱布过 滤，滤液补足至1000毫升，加入20-25克葡萄糖，溶化后115°C灭菌30min)。植物乳杆菌与鼠 李糖乳杆菌的培养基为MRS[配方(wt % ):牛肉膏1.0-1.5 %，蛋白腺1.0-1.5%，酵母膏0.5- 0.8 %，薦糖3.0-3.5 %，醋酸钢0.5-0.8 %，憐酸氨二钟0.2-0.5 %，巧樣酸锭0.2-0.5 %，硫 酸儀0.05-0.1 %，硫酸儘0.005-0.01 %，碳酸巧0.3-0.5 %，吐溫-80 1毫升/100毫升，余量 为水，pH 值 6.2-6.4]。
[0032] 2)将上述各菌种一级种子液分别在相应的灭菌培养液内进行二级混合扩大培养 制成二级扩大培养液。
[0033] 枯草芽胞杆菌、地衣芽抱菌及沼泽红假单胞菌二级混合扩大培养条件是:培养基 配方(wt%):牛肉膏1.0-1.5%，蛋白腺2.0-2.5%，酵母膏0.2-0.5%，薦糖0.5-1.0%，氯化 钢1.0-1.5 %，pH值7.0-7.2，余量为水。
[0034] 接种量各为5-lOwt%、溫度37±rC、揽拌速度150-200r/min、压力0.05MPa，培养 时间 15-20h.
[0035] 酿酒酵母与产航假丝酵母的二级混合培养条件是：培养基配方(wt%):酵母膏 1.0-1.5%，薦糖 3.0-5.0%，蛋白腺 1.0-2.0%，牛肉膏 0.5-1.0%，pH 值 7.2-7.4,余量为水。 接种量各为5-lOwt %，溫度30 ± rC，揽拌速度200-250r/min、压力0.05MPa，培养时间20- 2地。
[0036] 植物乳杆菌与鼠李糖乳杆菌二级混合扩大培养：
[0037] a.鲜巧樣+黄巧粉的水提取液的制备:按质量份数，称取鲜巧樣10份，绞粹，与黄巧 粉10份加入不诱钢提取锅内，加入100份水，加热至90-100°C浸煮30π?η，Ξ层纱布过滤，浸 煮2次，合并滤液，得到巧樣、黄巧水提取液；
[003引 6.按质量百分比(*1%):牛肉膏1.0-1.5%,蛋白腺1.0-1.5%,酵母膏0.5-0.8%， 薦糖3.0-3.5%，醋酸钢0.5-1.0%，憐酸氨二钟0.2-0.4%，巧樣酸锭0.2-0.5%，硫酸儀 0.05-0.1 %，硫酸儘0.005-0.01 %，碳酸巧0.3-0.5 %，吐溫-80:1毫升/100毫升，余量为步 骤a中制备的巧樣、黄巧水提取液，pH值6.2-6.4;
[0039] 二级混合培养条件:接种量5-lOwt%，静止培养，50-100r/min每小时间歇揽拌2- 5min，溫度控制30 ± rC，培养时间20-24h。
[0040] 3)将上述各菌的二级扩大培养液分别在相应灭菌培养基内进行Ξ级扩大培养制 成Ξ级扩大培养液。
[0041] 枯草芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌及沼泽红假单胞菌Ξ级混合培养条件是:培养基配 方同二级，接种量5-lOwt%、溫度37±rC、pH值7.0-7.2、揽拌速度150-20化/111111、压力 0.05MPa，培养时间 18-20h;
[0042] 酿酒酵母与产航假丝酵母扩大培养条件是:培养基配方同二级，溫度30 ± rC，pH 值7.2-7.4、揽拌速度 200-250r/min、压力 0.05MPa，培养时间 20-24h。
[0043] 植物乳杆菌与鼠李糖乳杆菌扩大培养:培养基配方同二级，培养条件:接种量5- lOwt%、静止培养，50-10化/min每小时间歇揽拌2-5min，溫度控制30±rC，培养时间20- 2地，发酵终止时抑值3.8-4.1
[0044] 4)将上述屯菌种的Ξ级扩大培养液，按1:1:1等体积混合均匀，得到菌剂混合液， 调整pH值3.8-4.1W增加菌液的稳定性。
[0045] 5)将上述菌剂混合液喷洒于灭菌麦教上，边喷洒边揽拌，使菌液均匀地吸附于麦 教-米慷上。
[0046] 6)在固体发酵罐内，控制含水率50-60%，30-40°C下发酵20-24h,
[0047] 再经过低溫40-45°C干燥，控制菌剂含水率在8-10 %，制得固体菌剂。固体菌剂有 效活性菌总菌落数>2.0-3.0*l〇WCFU/g，2株乳酸菌总菌落数> 1.0-1.8*l〇WCFU/g，3株细 菌总菌落数 >0.5-0.6*l〇iDCFU/g，2 株酵母总菌落数 >0.5-0.6*l〇iDCFU/g。
[0048] 7)将制成的固体菌剂密封于内衬聚乙締的包装袋内，室溫保存，防潮、防暴晒。存 放于阴凉干燥处。防止霉菌污染。
[0049] 所述的修复菌剂的有效活性菌总菌落数2.〇-3.0*1〇1<^〔。11/肖，其中酿酒酵母 (5日。油日1'〇1117。6 3。6'6￥131日6)4〔撕20037和产航假丝酵母（化]1(11(13 111:;[113)4〔〔〔20060为 0.5-0.6*l0iDCFU/g，枯草芽抱杆菌（Bacillus subtil is )ACCC10114+地衣芽抱杆菌 (Bacillus licheniformis)ACCC10146+沼泽红假单胞菌（lihodopseudomonas palustris) ACCC10649为0.5-0.6*l0i°CFU/g，植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum)ACCC10141+鼠李 糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus)ACCC10534为 1.0-1.8*l0i日CFU/g。
[0050] 下面结合【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明：
[0化1]实施例1
[0052] -种抗病毒抗病菌取代抗生素的禽畜肠道生态修复菌剂，包括酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)ACCC20037、产航假丝酵母（Candida util is)ACCC20060、枯 草芽抱杆菌（Bacillus subtil is )ACCC10114,地衣芽抱杆菌（Bacillus licheniformis) 八〔〔〔10146、沼泽红假单胞菌（拙〇(1〇93日11(1〇111〇]1日8 9日11131：1'13)4〔〔〔10649、植物乳杆菌 化actobacillus planta;rum)ACCC10141 和鼠李糖乳杆菌化actobacillus rhamnosus) ACCC10534。并含有巧樣、黄巧的水提成分(主成分是多糖）。所有菌种均购于中国农业微生 物菌种保藏管理中屯、(ACCC)，也是农业部允许在饲料添加剂中使用的益生菌菌种。无毒、无 害、无副作用。
[0053] 所述禽畜肠道生态修复菌剂的制备方法，将各菌种分别接种于相应的灭菌培养基 中进行活化、制备一级种子液;再经过二级、Ξ级混合液体扩大培养，将扩大培养的菌液吸 附于灭菌麦教-米慷上，再经过固体发酵、低溫干燥制得固体菌剂，具体步骤如下：
[0054] 1)将冰箱冷藏保存的各斜面菌种活化后，分别经试管、摇瓶扩大培养制成各菌的 一级种子液(各700毫升）；
[0055] 枯草芽胞杆菌、地衣芽抱杆菌与沼泽红假单胞菌的培养基为牛肉膏蛋白腺培养 基，按质量百分比：牛肉膏0.5-0.8%，蛋白腺1.0-1.5%，氯化钢0.5-0.8%，余量为水，pH值 7.0-7.2；
[0056] 酿酒酵母与产航假丝酵母的培养基为PDA,制备方法:按质量份数，取去皮马铃馨 200-250份，切成小块，加水1000份煮沸30min，Ξ层纱布过滤，滤液补足至1000份，加入20- 25份葡萄糖，溶化后115 °C灭菌30min;
[0057] 植物乳杆菌与鼠李糖乳杆菌的培养基为MRS,按质量百分比：牛肉膏1.0-1.5%，蛋 白腺1.0-1.5%，酵母膏0.5-0.8%，薦糖3.0-3.5%，醋酸钢0.5-0.8%，憐酸氨二钟0.2- 0.5 %，巧樣酸锭0.2-0.5 %，硫酸儀0.05-0.1 %，硫酸儘0.005-0.01 %，碳酸巧0.3-0.5 %， 吐溫-80每100毫升培养基加1毫升，余量为水，pH值6.2-6.4。
[005引2)将上述各菌种一级种子液分别在无菌培养基内进行二级混合扩大培养制成二 级扩大培养液，枯草芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌和沼泽红假单胞菌二级混合培养条件是:培养 基配方(wt%):牛肉膏1 %，蛋白腺2%，酵母膏0.2%，薦糖0.5%，氯化钢1 %。接种量各为 700毫升、溫度37± rC、pH值7.0-7.2、揽拌速度lOOr/min、压力0.05MPa，培养时间1她.
[0059] 酿酒酵母与产航假丝酵母的二级混合培养条件是：培养基配方(wt%):酵母膏 1 %，薦糖3 %，蛋白腺1 %，牛肉膏0.5 %，抑值7.2-7.4，接种量各700毫升，溫度30 ± rC，揽 拌速度150r/min、压力0.05MPa，培养时间2地。
[0060] 植物乳杆菌与鼠李糖乳杆菌二级混合扩大培养：
[0061] a、巧樣+黄巧粉的水提取液的制备:称取鲜巧樣10kg，绞粹，与黄巧粉10kg加入不 诱钢提取锅内，加入100升水，加热至90-100°C浸煮30min，Ξ层纱布过滤，浸煮2次，合并滤 液为巧樣+黄巧粉水提液。
[0062] b、按质量百分比(wt%):牛肉膏1.5%，蛋白腺1.5%，酵母膏0.8%，薦糖3.5%，醋 酸钢1.0%，憐酸氨二钟0.3%，巧樣酸锭0.5%，硫酸儀0.05%，硫酸儘0.01 %，碳酸巧 0.5 %，吐溫-80:1毫升/100毫升，余量为步骤a中制备的巧樣+黄巧水提取液，pH值6.2-6.4; 混合培养条件:接种量各700毫升，静止培养，lOOr/min每小时间歇揽拌2-5min，溫度控制37 ±1°(：，培养时间22}1。
[0063] 3)将上述各菌种二级混合培养液分别在相应灭菌培养基内进行Ξ级扩大培养制 成Ξ级扩大培养液。
[0064] 枯草芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌及沼泽红假单胞菌Ξ级混合培养条件是:培养基配 方同二级，接种lOwt%、溫度37±rC、pH值7.0-7.2、揽拌速度15化/111111、压力0.051?日，培养 时间 18-20h;
[0065] 酿酒酵母与产航假丝酵母Ξ级混合扩大培养条件是:培养基配方同二级，接种量 lOwt %，溫度30 ± rC .揽拌速度200r/min，培养时间2地。
[0066] 植物乳杆菌与鼠李糖乳杆菌混合扩大培养:培养基配方同二级，培养条件:接种量 lOwt %，静止培养，50-100r/min每小时间歇揽拌2-5min，溫度控制37 ± rC，培养时间22h. 发酵终止时调整pH值3.8-4.1W增加菌液的稳定性。
[0067] 4)将上述屯菌种的Ξ级扩大培养液，按1:1:1等体积混合均匀，得到菌剂混合液；
[0068] 5)将上述菌剂混合液喷洒于灭菌麦教-米慷上，边喷洒边揽拌，使菌液均匀地吸附 于灭菌麦教-米慷上。
[0069] 6)再经过固体发酵、低溫干燥制得固体菌剂。固体发酵的条件：接种量(wt%) 50 %，罐体溫度40-45 °C，发酵2地.控溫40-45 °C，干燥20-24h，控制含水率9 %。
[0070] 7)将制成的固体菌剂密封于内衬聚乙締膜的包装袋内，室溫保存，防潮、防暴晒。 存放于阴凉干燥处，防止霉菌污染。保质期12个月。
[0071] 该实施例制备的固体菌剂的测定。
[0072] 1、质量控制指标
[0073] 含水率(105°C恒重法)8-10%pH值4.1-5.5有效活性菌总菌落数>2.5*1〇1咐^/邑， 乳酸菌总菌落数>1.5*1〇1化即/g，酿酒酵母与产航假丝酵母总菌落数>0.5*1〇1化即/g，枯 草芽抱杆菌+地衣芽抱杆菌+沼泽红假单胞菌总菌落数>〇.5*l〇WCRJ/g。
[0074] 2、养猪场试验效果
[0075] 地点:河南尉氏县某生猪养殖场
[0076] 试验设计:35日龄仔猪42头，平均体重7.80kg.随机分为对照组和试验组，每组设3 个平行组，每组7头仔猪。对照组饲喂仔猪全日粮，免疫程序照旧，自由饮水;试验组在饲喂 仔猪全日粮基础上，平均每日每头仔猪添加2克益生菌菌剂，充分混合于饲料(去除抗生素、 脱霉剂、甜味剂的全日粮），不参加免疫程序，其他条件与对照组完全相同，自由饮水。
[0077] 试验结果:见表1
[0078] 表1各项测定指标比较
[0079]
[0080] 结论
[OOW] 试验组与对照组相比，料肉比降6.64%，腹泻率降低98.04%，死淘率降低 83.76%，效果显著。另外，从对2周后粪样检测结果看，对照组粪样中仍有大量霉菌，达5.8* 105CFU/g(58万），而乳酸菌也仅有1.35*105CFU/g，而试验组的霉菌菌仅有290个，乳酸菌达 到1.36*106CFU/g，是对照组的10倍之多。说明试验组仔猪肠道菌群调整到位，乳酸菌占到 优势，肠道菌群趋于生态平衡。
[0082]本发明是益生菌+中药的肠道生态修复菌剂，利用黄巧中的多糖，巧樣中的巧樣 素、多糖W及各益生菌所产胞外多糖，达到调整禽畜肠道菌群生态平衡，提高机体免疫力， 抗病毒抗病菌的目的。通过大量试验证实益生菌+中药的菌剂，可W明显提高机体免疫力， 使肠道的霉菌、大肠杆菌等显著减少，而乳酸菌(有益菌类)显著增多。禽畜的呼吸道疾病和 肠道疾病大大降低，料肉比降低，提高饲料报酬，生产性能提高。完全可W替代抗生素。菌剂 中所用菌种都是国家农业部2045号公告（2013)所允许使用的益生菌。所用中药-黄巧是国 家Ξ类兽药。另外，所用的巧樣全果是公认的可直接食用的鲜果（四川安岳巧樣生产基地）。 制剂生产过程中都是采用不诱钢设备和玻璃制品制备，不会引入有毒、有害物质，安全可 靠。整个生产过程中因都是用电加热，没有"Ξ废"产生。
[0083] W上所述的实施例仅用于说明本发明的技术思想及特点，其目的在于使人能够理 解本发明的内容并据W实施，不能仅W本实施例来限定本发明的专利范围，即凡本发明所 掲示的设计思路所作的同等变化或修饰，仍属于本发明的专利范围内。
【主权项】
1. 一种抗病毒抗病菌取代抗生素的禽畜肠道生态修复菌剂，其特征在于，包括酿酒酵 母（3&。。11&1'〇1115^68。6代￥丨8丨&6)厶〇(^20037、产|]元假丝酵母（〇&11(1丨(1&111:;[1丨8从〇〇〇20060、 枯草芽抱杆菌(Bacillus subtil is )ACCC10114，地衣芽抱杆菌(Bacillus licheniformis) ACCC10146、沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonas palustris)ACCC10649、植物乳杆菌 (Lactobaci 1 lus plantarum)ACCC10141 和鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus) ACCC10534。2. 根据权利要求1所述的抗病毒抗病菌取代抗生素的禽畜肠道生态修复菌剂，其特征 在于，还包括柠檬、黄芪的水提物。3. 根据权利要求1或2所述的抗病毒抗病菌取代抗生素的禽畜肠道生态修复菌剂，其特 征在于，所述的修复菌剂的有效活性菌总菌落数2.0-3.0*10 1()CFU/g，其中酿酒酵母 (3已(^11&1'〇1115^6 8〇6代￥181&6从(^〇20037和产|]元假丝酵母(〇&11(11(1&111:;[118从〇(^20060为 0.5-〇.6*101QCFU/g，枯草芽抱杆菌（Bacillus subtilis)ACCC10114+地衣芽抱杆菌 (Bacillus licheniformis)ACCC10146+沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonas palustris) ACCC10649为0.5-0.6*101QCFU/g，植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum)ACCC10141+鼠李 糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus)ACCC10534为1.0-1.8*101QCFU/g〇4. 一种如权利要求1所述抗病毒抗病菌取代抗生素的禽畜肠道生态修复菌剂的制备方 法，其特征在于，将各菌种分别单独活化，接种于相应的灭菌培养基中进行一级种子液扩大 培养，在二级、三级发酵时按照相近与共生的原则，将2株酵母混合发酵，3株细菌混合发酵， 2株乳酸菌混合发酵，再将三者混合扩大培养菌液按1:1:1等体积混合后吸附于灭菌麦麸-米糠上，再经过固体发酵阶段，最后低温干燥，制得固体菌剂，具体步骤如下： 1) 将冰箱冷藏保存的各斜面菌种分别单独活化后，分别经摇瓶扩大培养制成一级种子 液； 2) 将上述各菌种的一级种子液分别在灭菌培养基内进行二级混合扩大培养制成二级 扩大培养液： 产朊假丝酵母与酿酒酵母的二级混合培养条件是：接种量各为5-lOwt%、温度30±1 °C、搅拌速度200-250r/min、压力0.05MPa，培养时间20-24h，培养基配方，按质量百分比：酵 母膏 1.0-1.5%，蔗糖 3.0-5.0%，蛋白胨 1.0-2.0%，牛肉膏 0.5-1.0%，ρΗ 值 7.2-7.4,余量 为水； 枯草芽胞杆菌、地衣芽孢杆菌和沼泽红假单胞菌二级混合培养条件是:接种量各为5-10wt%、温度37±1°C、搅拌速度100_150r/min、压力0.05MPa，培养时间15-20h，培养基配 方，按质量百分比：牛肉膏1.0-1.5%，蛋白胨2-2.5%，酵母膏0.2-0.5%，蔗糖0.5-1.0%， 氯化钠1.0-1.5 %，pH值7.0-7.2，余量为水； 植物乳杆菌与鼠李糖乳杆菌的一级种子液在灭菌培养基内进行二级混合扩大培养制 成二级扩大培养液，培养条件是:接种量各为5-10wt %，静止培养，50-100r/min每小时间歇 搅拌2-5min，温度控制30-37°C，培养时间20-24h，培养基制备： a. 鲜柠檬+黄芪粉的水提取液的制备:按质量份数，称取鲜柠檬10份，绞粹，与黄芪粉10 份加入到不锈钢提取锅内，加入100份水，加热至90-100°C浸煮30min，三层纱布过滤，浸煮2 次，合并滤液，得到柠檬、黄芪水提取液； b. 按质量百分比：牛肉膏1.0-1.5%，蛋白胨1.0-1.5%，酵母膏0.5-0.8%，蔗糖3.0- 3.5 %，醋酸钠0.5-1.0 %，磷酸氢二钾0.2-0.4 %，柠檬酸铵0.2-0.5 %，硫酸镁0.05-0.1 %， 硫酸锰0.005-0.01 %，碳酸钙0.3-0.5%，吐温-80:1毫升/100毫升，余量为步骤a中制备的 柠檬、黄芪水提取液，pH值6.2-6.4; 3) 将上述各菌的二级混合扩大培养液分别在灭菌培养基内进行三级混合扩大培养制 成三级扩大培养液： 产朊假丝酵母与酿酒酵母三级混合扩大培养条件是：接种量5-lOwt%、温度30 土 TC、 pH值7 · 2-7 · 4、搅拌速度200-250r/min、压力0 · 05MPa，培养时间20-24h，培养基同二级； 枯草芽胞杆菌、地衣芽孢杆菌和沼泽红假单胞菌三级混合扩大培养条件是:接种量5-1(^七％、温度37±1°(：4!1值7.0-7.2、搅拌速度150-20(^/1^11、压力0.051〇^，培养时间18-20h，培养基同二级； 植物乳杆菌与鼠李糖乳杆菌三级扩大培养:接种量5-lOwt %，静止培养，50-100r/min 每小时间歇搅拌2-5min，温度控制30-37 °C，培养时间20-24h，发酵终止时调整pH值3.8-4.1以增加乳酸菌的稳定性，培养基同二级； 4) 将上述三类混合菌的三级扩大培养液，按1:1:1等体积混合均匀，得到菌剂混合液； 5) 将上述菌剂混合液按照质量比0.5 :1喷洒于灭菌麦麸-米糠上，边喷洒边搅拌，使菌 液均匀地吸附、固化于麦麸-米糠上，经过固体发酵、低温干燥，最后制得固体菌剂； 6) 将制成的固体菌剂密封于内衬聚乙烯膜的包装袋内，室温保存，防潮、防暴晒。5. 根据权利要求4所述抗病毒抗病菌取代抗生素的禽畜肠道生态修复菌剂的制备方 法，其特征在于，所述菌种活化方法是:把琼脂斜面保存的各菌菌种从冰箱冷藏室取出，放 于超净工作台内，在酒精灯火焰旁，分别转接于琼脂平板培养基上，在30-37 °C下培养20-30h后，平板上生长出大大小小的菌落，再从平板上菌落中挑取单菌落转接于灭菌试管中的 培养液中。6. 根据权利要求4所述抗病毒抗病菌取代抗生素的禽畜肠道生态修复菌剂的制备方 法，其特征在于，所述步骤1)中活化后的每个菌种单独扩大培养的培养基分别是： 枯草芽胞杆菌、地衣芽孢杆菌与沼泽红假单胞菌的培养基为牛肉膏蛋白胨培养基，按 质量百分比：牛肉膏0.5-0.8%，蛋白胨1.0-1.5%，氯化钠0.5-0.8%，余量为水，pH值7.0-7.2； 酿酒酵母与产朊假丝酵母的培养基为PDA，制备方法：按质量份数，取去皮马铃薯200-250份，切成小块，加水1000份煮沸30min，三层纱布过滤，滤液补足至1000份，加入20-25份 葡萄糖，溶化后115°C灭菌30min; 植物乳杆菌与鼠李糖乳杆菌的培养基为MRS，按质量百分比：牛肉膏1.0-1.5 %，蛋白胨 1.0-1.5 %，酵母膏0.5-0.8 %，蔗糖3.0-3.5 %，醋酸钠0.5-0.8 %，磷酸氢二钾0.2-0.5 %， 柠檬酸铵〇. 2-0.5 %，硫酸镁0.05-0.1 %，硫酸锰0.005-0.01 %，碳酸钙0.3-0.5 %，吐温-80 每100毫升培养基加1毫升，余量为水，pH值6.2-6.4。7. 根据权利要求4所述抗病毒抗病菌取代抗生素的禽畜肠道生态修复菌剂的制备方 法，其特征在于，所述步骤5)中在固体发酵罐内，控制含水率50-60%，30-40°C下发酵20-24h，再经过低温40-45°C干燥，控制菌剂含水率在8-10%，制得固体菌剂，固体菌剂有效活 性菌总菌落数彡2.0-3.0*10 1()CFU/g，2株乳酸菌总菌落数彡1.0-1.8*101()CFU/g，3株细菌总 菌落数多 0 · 5-0 · 6*101QCFU/g，2 株酵母总菌落数多 0 · 5-0 · 6*101QCFU/g。
【文档编号】C12R1/01GK106011001SQ201610344955
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月23日
【发明人】张清敏
【申请人】天津蕾檬佰翱科技发展有限公司