一种基因gBabc的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种从牛传染性鼻气管炎病毒的主要抗原糖蛋白gB中得到的基因gBabc,该基因表达能够得到高免疫原活性的融合蛋白，最后制作用于检测牛传染性鼻气管炎抗体的胶体金免疫层析试纸条。本发明的目的基因成功高效表达、分离纯化得到用于检测牛传染性鼻气管炎抗体的融合抗原蛋白gBF，且经实验验证该融合蛋白具有高抗原性及高免疫活性，建立了牛传染性鼻气管炎抗体胶体金免疫层析方法。
【专利说明】
一种基因 gBabc
技术领域
[0001] 本发明设及一种从牛传染性鼻气管炎病毒的主要抗原糖蛋白gB中得到的目的基 因浊abc。
【背景技术】
[0002] 牛传染性鼻气管炎（Infectious bovine ;rhinotracheitis,IBR)是由牛传染性鼻 气管炎病毒（IBRV)也称牛瘤疹病毒I型(Bovine he巧esvirusI，BHV-I)引起牛的一种急性、 热性、接触性传染病，临床症状有上呼吸道及气管粘膜发炎、呼吸困难、流鼻汁等，并伴有结 膜炎、流产、乳腺炎，有时诱发小牛脑炎等。更严重的危害是导致持续性感染，给诊断、预防 及治疗该病造成极大的困难。牛传染性鼻气管炎病毒粒子最外层的囊膜由11种糖蛋白组 成，其中gB、gC和曲糖蛋白具有高免疫原性，能够刺激机体产生抗体并在补体存在下致使感 染细胞裂解。
[0003] 目前，IBR的鉴别诊断方法主要包括传统的病毒分离、血清学实验、聚合酶链式反 应(PCR)技术等，其中血清学实验又包括血清中和实验、琼脂扩散实验、间接血凝实验和 ELISA诊断方法。运些检测方法对操作步骤、操作环境、仪器设备的要求都很高，很难应用于 临床诊断。
【发明内容】
[0004] 为了解决上述的技术问题，本发明的目的是提供一种从牛传染性鼻气管炎病毒的 主要抗原糖蛋白浊中获得目的基因浊abc。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
[0006] 一种基因浊abc，所述基因的核巧酸序列如序列表SEQ ID NO: 1所示。
[0007] Jinybude，所述的基因 gBalDc表达得到融合蛋白gBF，具有如序列表SEQ ID N0:1所 示的氨基酸序列。
[000引基因浊abc的合成方法，包括如下的步骤：
[0009]利用DNAstar对牛传染性鼻气管炎病毒的主要抗原糖蛋白浊进行预测分析，选出3 段抗原指数高的抗原表位基因，根据3段氨基酸序列起始位置找出3段对应基因序列，并分 别命名为gBa、g抓和浊c，3段基因序列之间用Linker序列连接，并选定EcoR I和趾0 I为酶 切位点，将融合好的基因序列送与合成得到重组克隆载体PUCK-(gBa-linke;r-g化-linke;r- gBc) ，重组克隆载体存在于大肠杆菌 DH-5a 中，通过摇菌的方式克隆 W 及扩增目 的基因 ，通 过质粒提取、双酶切W及胶回收得到带有粘性末端的目的基因浊abc。
[0010]基因浊abc表达得到融合蛋白浊F的方法，包括如下的步骤：
[0011]将基因 gBabc与线性化表达载体pET-28a( + )进行连接得到重组原核表达载体 pET28a-浊abc,并将其转化入表达菌化21 pLysS中，表达菌化21 pLysS经IPTG诱导表达，通 过SDS-PAGE选取最适的诱导表达时间、鉴别是可溶性表达还是包涵体表达W及确定表达蛋 白带的大小为44.3kDa(含3.5kDa的祀T-28a( + )肤段），与理论计算的目的蛋白大小一致，将 鉴定正确的目的蛋白大量诱导表达，并分离纯化得到融合蛋白浊F。
[0012] 利用所述的融合蛋白浊F制作的检测牛传染性鼻气管炎抗体的胶体金免疫层析试 纸条，该试纸条包括PVC胶板，所述PVC胶板中间设置有硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜两 侧的PVC胶板上分别设置有血清样品垫和吸水纸，所述血清样品垫与所述硝酸纤维素膜之 间设置有金标垫，所述金标垫上涂覆有经复溶缓冲液稀释的金标-SPA，所述金标垫的一端 位于所述血清样品垫下端，另一端位于所述硝酸纤维素膜上端;所述硝酸纤维素膜上靠近 金标垫一端上设置有用牛传染性鼻气管炎病毒融合蛋白gBF划线作为捕获抗原的检测线， 所述硝酸纤维素膜上背离金标垫一端上设置有用兔IgG划线作为捕获抗体的质控线。
[0013] 与现有技术相比，本发明的有益技术效果：目的基因成功高效表达、分离纯化得到 用于检测牛传染性鼻气管炎抗体的融合抗原蛋白gBF,且经实验验证该融合蛋白具有高抗 原性及高免疫活性;制成的试纸条具有快速、简便、准确、高度特异性和敏感性，且结果直观 可靠等优点，适用于牛传染性鼻气管炎的临床检测。
【附图说明】
[0014] 下面结合【附图说明】对本发明作进一步说明。
[0015] 图1为本发明中胶体金免疫层析试纸条的结构示意图；
[0016] 附图标记说明：1-PVC胶板;2-血清样品垫;3-金标垫(涂覆有金标-SPA)
[0017] 4-硝酸纤维素膜;5-样品层析方向；6-检测线/T线（融合蛋白gBF作为捕获抗原）； 7-质控线/C线(兔IgG作为捕获抗体）；8-吸水纸。
[0018] 图2为IBRV浊蛋白抗原表位分析及筛选结果；
[0019] 图3为祀T28a-gBabc阳性菌各时间点的表达产物SDS-PAGE鉴定结果；
[0020] 图4为祀T28a-gBabc阳性菌表达蛋白可溶性的SDS-PAGE鉴定结果；
[0021] 图5为融合蛋白浊F的Western blot鉴定结果；
[0022] 图6为检测试纸条有效性的验证结果；
[0023] 图7为检测试纸条交叉性试验结果。
【具体实施方式】
[0024] 本实验利用DNAstar对牛传染性鼻气管炎病毒的主要抗原糖蛋白gB进行预测分 析，选出3段抗原指数高的抗原表位基因，根据3段氨基酸序列起始位置找出3段对应基因序 列，并分别命名为浊a、浊b和浊c，3段基因序列之间用Linker序列连接，并选定EcoR巧日化0 I为酶切位点，将融合好的基因序列送与合成得到重组克隆载体PUCK-(gBa-linker-g化- linker-gBc)。重组克隆载体存在于大肠杆菌DH-5a中，通过摇菌的方式克隆W及扩增目的 基因，通过质粒提取、双酶切W及胶回收得到带有粘性末端的目的基因 gBabc(核巧酸序列 如序列表SEQ ID NO: 1所示），将其与线性化表达载体祀T-28a( + )进行连接得到重组原核表 达载体祀T28a-gBabc，并将其转化入表达菌化21 pLysS中。表达菌化21 pLysS经IPTG诱导 表达，通过SDS-PAGE选取最适的诱导表达时间、鉴别是可溶性表达还是包涵体表达W及确 定表达蛋白带的大小为44.3kDa(含3.化化的pET-28a( + )肤段），与理论计算的目的蛋白大 小一致。将鉴定正确的目的蛋白大量诱导表达，并分离纯化得到融合蛋白gBF(氨基酸序列 如序列表SEQ ID N0:2所示），通过Weatern blot对融合蛋白浊F的免疫学活性进行鉴定，结 果表明目的蛋白具有很好的免疫学活性，且融合蛋白gBF能够在大肠杆菌化21 pLysS中获 得高效的重组表达。
[0025]如图1所示，一种检测牛传染性鼻气管炎抗体的胶体金免疫层析试纸条，先将吸水 纸8和硝酸纤维素膜4粘覆与PVC胶板1上，将分离纯化的牛传染性鼻气管炎病毒融合蛋白 gBF划线于硝酸纤维素膜上作为检测线6上的包被抗原，提纯的兔IgG划线于硝酸纤维素膜 上作为质控线7上的捕获蛋白，金标-SPA用复溶缓冲液稀释后涂覆在金标垫3上，样品垫经 样品点处理液处理烘干，再将金标垫3与血清样品垫2粘覆在PVC胶板1上，经切条后组装卡 槽，制成用于检测牛传染性鼻气管炎抗体的胶体金免疫层析试纸条。用检测试纸条检测牛 传染性鼻气管炎标准阳性血清，在检测线处出现红色反应带，检测阴性血清时试纸条检测 线处未出现反应条带，上述两种检测在质控线处均出现红色反应条带，表明用试纸条检测 牛传染性鼻气管炎标准阳性血清时呈阳性反应，检测阴性血清时呈阴性反应;试纸条检测 牛传染性鼻气管炎阴性血清、牛副结核病、牛布氏杆菌病和牛口蹄疫的阳性血清，结果都为 阴性反应;用保存于室溫1个月的试纸条与保存于4°C1个月的试纸条分别检测牛传染性鼻 气管炎标准阳性血清和阴性血清，检测的牛传染性鼻气管炎标准阳性血清都成阳性反应， 检测阴性血清时呈阴性反应。所制备的试纸条具有灵敏、特异的优点，稳定性好，lOmin后即 出结果，操作简便，可用于临床诊断。
[00%]相关实验如下：
[0027] UIBRV浊蛋白DNAstar分析及抗原蛋白和基因筛选结果
[002引如图2所示，IBRVgB蛋白抗原表位分析及筛选结果，根据DNAstar对IBRV浊蛋白序 列(945个氨基酸）的分析结果，截取氨基端第308-450，494-598，822-924，3段潜在抗原决定 簇多、亲水性强和柔初性好的氨基酸序列。根据3段氨基酸序列起始位置找出对应基因序 列，并分别命名为gBa、浊b和gBc，3段基因片段之间用Linker序列连接，整个基因序列两端 设计了EcoR巧日趾0 I两个酶切位点，得到融合好的基因，基因序列如序列表SEQ ID NO: 1 所示。其中3段基因片段之间用Linker序列连接位置如序列表SEQ ID NO: 1中双下划线位置 所示。
[0029] 2、祀T28a-gBabc阳性菌各时间点的表达产物SDS-PAGE鉴定
[0030] 如图3所示，pET28a-gBabc阳性菌各时间点的表达产物SDS-PAGE鉴定结果。将制备 的5个时间点的上样蛋白及对照蛋白上样进行SDS-PAGE电泳鉴定，结果如图3所示，重组表 达菌诱导之后出现一条大小约为44.3kDa的特异性条带，与理论计算的目的蛋白大小一致， 而重组质粒阳性菌未诱导对照和空载菌液对照均未出现目的条带，且经目的条带的颜色深 浅能够明显判断融合蛋白浊F在诱导后化的表达量最大。
[0031 ] 图中：Ml:预染彩虹Marker ;M2:预染蛋白质Marker; 1~5:分别为祀T28a-gBabc阳 性菌在诱导后化、地、化、6h、化菌体总蛋白；6:pET28a-gBabc阳性菌未诱导对照；7:pET-28a (+ )空载菌液对照。
[0032] 3、祀T28a-gBabc阳性菌表达蛋白可溶性的SDS-PAGE鉴定
[0033] 如图4所示，收集重组表达质粒阳性菌在诱导后化的菌体，超声裂解后分别收集上 清和沉淀并加入上样缓冲液沸水浴变性制备上样蛋白进行SDS-PAGE鉴定，结果如图4所示， 菌体总蛋白作对照，上清中没有出现目的蛋白条带，沉淀中出现大小约为44.3的蛋白条带， 说明融合蛋白浊F在本试验诱导条件下为包涵体形式表达。
[0034]图中：M:预染蛋白质Marker; 1:重组质粒阳性菌在诱导后化的菌体总蛋白；2:菌体 裂解后的上清;3:菌体裂解后的沉淀。
[OO%] 4、融合蛋白浊F的Western blot鉴定结果
[0036] 如图5所示，纯化后的蛋白经Western blot鉴定后的结果如图5所示，在大小约 44.3kDa的位置出现特异性目的条带，而阴性血清对照没有出现特异性条带，说明经IPTG诱 导表达并纯化后得到的融合蛋白浊F拥有很好的免疫学活性。
[0037] 图中：M:Weste;rn blot Marke;r;l:融合蛋白浊F;2:g邸蛋白阴性血清反应对照。
[0038] 5、检测试纸条有效性的验证结果
[0039] 将制成的试纸条装入卡槽，分别用IB財示准阳性血清及试验室保存的IB郎日性血清 和阴性血清对试纸条进行验证，结果如图6所示，阳性结果在检测线和质控线均出现红色条 带，阴性结果只在质控线出现红色条带而检测线未出现显色，与预期结果一致。
[0040] 图中：1: IBR标准阳性血清；2:试验室保存IBR阳性血清;3:试验室保存IBR阴性血 清。
[0041 ] 6、检测试纸条交叉性试验结果
[0042] 用检测试纸条同时检测牛副结核病、牛布鲁菌病、牛病毒性腹泻和牛口蹄疫阳性 血清，结果如图7所示，观察结果并与IBR标准阳性血清结果和阴性血清结果比较，结果说明 本试验制备的检测试纸条在检测IBR抗体时，与上述4种阳性血清无明显的交叉反应。
[0043] 图中：1: IBR标准阳性血清;2:试验室保存IBR阴性血清;3~6:分别为牛副结核病、 牛布鲁菌病、牛病毒性腹泻和牛口蹄疫阳性血清。
[0044] W上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行 限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出 的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
【主权项】
1. 一种基因 gBabc，其特征在于:所述基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO: 1所示。2. 根据权利要求1所述的基因 gBabc表达得到融合蛋白gBF，具有如序列表SEQ ID N0:1 所示的氨基酸序列。3. 权利要求1所述的基因 gBabc的合成方法，其特征在于:包括如下的步骤： 利用DNAstar对牛传染性鼻气管炎病毒的主要抗原糖蛋白gB进行预测分析，选出3段抗 原指数高的抗原表位基因，根据3段氨基酸序列起始位置找出3段对应基因序列，并分别命 名为gBa、gBb和gBc，3段基因序列之间用Linker序列连接，并选定EcoR I和Xho I为酶切位 点，将融合好的基因序列送与合成得到重组克隆载体PUCKgBa-linker-gBb-linker-gBc) ，重组克隆载体存在于大肠杆菌 DH-5a 中 ，通过摇菌的方式克隆以及扩增目 的基因 ，通 过质粒提取、双酶切以及胶回收得到带有粘性末端的目的基因 gBabc。4. 根据权利要求1所述的基因 gBabc表达得到融合蛋白gBF的方法，其特征在于:包括如 下的步骤： 将基因 gBabc与线性化表达载体pET-28a( + )进行连接得到重组原核表达载体pET28a-gBabc，并将其转化入表达菌BL21pLysS中，表达菌BL21pLysS经IPTG诱导表达，通过SDS-PAGE选取最适的诱导表达时间、鉴别是可溶性表达还是包涵体表达以及确定表达蛋白带的 大小为44.3kDa(含3.5kDa的pET-28a( + )肽段），与理论计算的目的蛋白大小一致，将鉴定正 确的目的蛋白大量诱导表达，并分离纯化得到融合蛋白gBF。5. 根据权利要求2所述的融合蛋白gBF制作的检测牛传染性鼻气管炎抗体的胶体金免 疫层析试纸条，其特征在于:包括PVC胶板，所述PVC胶板中间设置有硝酸纤维素膜，所述硝 酸纤维素膜两侧的PVC胶板上分别设置有血清样品垫和吸水纸，所述血清样品垫与所述硝 酸纤维素膜之间设置有金标垫，所述金标垫上涂覆有经复溶缓冲液稀释的金标-SPA，所述 金标垫的一端位于所述血清样品垫下端，另一端位于所述硝酸纤维素膜上端;所述硝酸纤 维素膜上靠近金标垫一端上设置有用牛传染性鼻气管炎病毒融合蛋白gBF划线作为捕获抗 原的检测线，所述硝酸纤维素膜上背离金标垫一端上设置有用兔IgG划线作为捕获抗体的 质控线。
【文档编号】C12N15/70GK106047902SQ201610355921
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年5月26日
【发明人】秦建华, 刘腾, 赵月兰, 史万玉, 包永占, 景翠, 王敏, 赵越, 刘立元
【申请人】河北农业大学