一种获得稳定的烟粉虱MED隐种BtTRP基因突变系的方法
【专利摘要】本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种获得稳定的烟粉虱MED隐种BtTRP基因突变系的方法。所述方法包括以下步骤：BtTRP基因突变品系的获得、获得亲本F0代、获得杂交F1代、自交F2代；高温胁迫检测，及低温胁迫检测，获得稳定的烟粉虱MED隐种BtTRP基因突变系。
【专利说明】
-种获得稳定的烟粉動MED隐种BtTRP基因突变系的方法
技术领域
[0001] 本发明设及基因工程领域，具体设及一种获得稳定的烟粉風M抓隐种化TRP基因突 变系的方法。
【背景技术】
[0002] 烟粉風 Bemisia tabaci(Gennadius)属半翅目（Hemiptera)粉風科 (Aleyrodidae)，小粉風属Bemisia，属于世界性的入侵害虫。烟粉風M抓隐种自2003年首次 在中国云南昆明发现，至今为止，已几乎遍布全国各省，并逐渐取代烟粉風MEAM1隐种，成为 危害我国农作物的主要烟粉風隐种。对于烟粉風M抓隐种快速入侵适应并在我国成为优势 种的机制研究备受研究者的青睐，其中入侵机制的分子生物学研究是研究热点之一。但由 于烟粉風是非模式物种，相关的基因组信息比较少，能进行机理研究的实验工具和手段也 比较缺乏，因此对其发生机制仍不清楚。Clustered regularly interspaced short 口日1；[]1化0111；[。'696日13(〔1?15?10/〔1?15?1?-日3 30。1日16(1(化3)技术的诞生打破了模式物种与 非模式物种之间的壁垒，使得在非模式物种中进行遗传修饰变成现实。
[0003] CRISPR/Cas是细菌特有的一种获得性免疫系统，其原理是通过在生物基因组特定 位点制造 DNA双链断裂(double-strand break,DSB)损伤，从而激活机体自身的DNA损伤修 复机制，在此过程中引发各种变异。CRISPR/tas9技术的诞生打破了模式物种与非模式物种 之间的壁垒，使得在非模式物种中进行遗传修饰变成现实。然而，CRISPR/化s9系统存在脱 祀效应的问题，限制其从核基因水平抑制目的基因表达的技术效果，难W达到持久稳定的 效果。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种获得稳定的烟粉風M邸隐种化TRP基因突变系的方法。
[0005] 根据本发明的获得CRISPR/Cas9系统诱导的烟粉風M抓隐种化TRP基因突变系的方 法包括W下步骤：
[0006] (l)BtTRP基因突变品系的获得，包括W下步骤：
[0007] (1 -1) BtTRP 基因 sgRNA 引物的设计：
[000引基于烟粉風MED隐种的BtTRP基因序列，设计SgRNA的祀标位点，引物序列如下：
[0009] MED-F：
[0010] GAAATTAATACGACTCACTATAGGACCAGGAGAGAGGCAAACTCGTTTTAGAGCTAGA
[0011] AATAGC；
[0012] sgRNA-R：
[00。] AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTMC
[0014] TTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC，
[0015] (1-2)合成化 TRP 基因 SgRNA，
[0016] (1-3)合成化39111尺酷，
[0017] (1-4)显微注射，将步骤（1-2)获得的BtTRP基因 sgRNA和步骤（1-3)获得的 化s9mRNA混合，摩尔比为2:1，注射至烟粉風M抓隐种红眼期伪蛹，培育获得化TRP基因突变 品系；
[001引（2)获得亲本F0代；
[0019] (3)获得杂交F1代；
[0020] (4)获得自交F2代；
[0021] (5)高溫胁迫检测，及低溫胁迫检测，获得稳定的烟粉風M抓隐种化TRP基因突变 系。
[0022] 根据本发明的获得CRISPR/Cas9系统诱导的烟粉風M抓隐种化TRP基因突变系的方 法，其中，在步骤(1-4)中，注射后的烟粉風M邸隐种红眼期伪蛹的培育条件为:溫度为26±1 °(：，相对湿度60-80%，光周期为161^:80。
[0023] 本发明基于烟粉風CRISPR/Cas9系统平台，研究CRISPR/Cas9系统诱导烟粉風MED 隐种化TRP基因突变的遗传性分析。
[0024] 本发明通过CRISPR/Cas9系统构建的烟粉風M邸隐种突变品系和烟粉風M抓隐种野 生型品系进行杂交，对杂交后代的高低溫胁迫检测，进而探究CRISPR/Cas9系统诱导基因突 变的可遗传性。本发明使用CRISPR/Cas9系统所诱导的基因突变可通过种系间遗传给后代， 形成稳定的突变品系，为进一步利用诱导基因突变来实现害虫的生物防治提供理论基础。
【附图说明】
[0025] 图1不同杂交组合F2代烟粉風之间耐热性表型值差异，即观察高溫胁迫后击倒时 间。数据为均值±标准误，单个处理样本量为500头。小写字母表示耐热性存在显著差异。(P <0.05)
[0026] 图2不同杂交组合F2代烟粉風之间耐寒性表型值差异，即观察低溫胁迫后恢复时 间。数据为均值±标准误，单个处理样本量为500头。小写字母表示耐热性存在显著差异。(P <0.05)
【具体实施方式】
[0027] 实施例1:烟粉風M邸隐种化TRP基因突变品系的获得
[002引 UBtTRP基因 SgRNA引物的设计：
[0029] 基于烟粉風MED隐种的BtTRP基因序列，设计SgRNA的祀标位点，引物序列如下：
[0030] MED-F：
[0031] GAAATTAATACGACTCACTATAGGACCAGGAGAGAGGCAAACTCGTTTTAGAGCTAGA
[0032] AATAGC；
[0033] sgRNA-R：
[0034] AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAAC
[0035] TTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC 〇
[0036] 2、合成化 TRP 基因 SgRNA:
[0037] 3、合成 Cas9mRNA
[0038] 4、显微注射
[0039] 注射试剂:在30化体系中，将0.扣g sgRNA和lOiig化s9mRNA混合(大约摩尔比为2: 1 )，溶于化L 3M的醋酸钢溶液中（pH 5.2)，并用3倍体积的无水乙醇沉淀浓缩(-20°C过夜沉 淀）。12000巧m离屯、30min，加75 %的乙醇，12000巧m离屯、5min，重复一次，注射前用11化水重 〇
[0040] 注射方法:收集烟粉風M抓隐种红眼期伪蛹，排列并粘附在事先贴有透气双面胶的 盖玻片表面上。使用Femtojet Express化ppendo;rf)，femtotip 11针化ppendo;rf)和 InjectMan NI 2显微注射仪，从尾端注射，注射压强为llOOhPa左右，注射时间为0.1 s。
[0041 ]培育方法:将盖玻片放置在琼脂培养基上，放入人工气候箱中使其完成发育。溫度 为26±rC，相对湿度60-80%，光周期为16L:8D。
[0042] 5、BtTRP基因突变品系获得
[0043] 上述所获得的显微注射sgRNA和化s9mRNA混合液诱导形成的突变型烟粉風即为烟 粉風M邸隐种化TRP基因突变品系。
[0044] 实施例2: CRISPR/化s9系统诱导的烟粉風M抓隐种化TRP基因突变品系的遗传性分 析
[0045] 通过CRISPR/化s9技术获得烟粉風M抓隐种化TRP基因突变品系：sgRNA引物的设计 和合成、&s9mRNA的合成、显微注射和化TRP基因突变品系的获得，同实施例1。
[0046] (1)亲本F0代的获得:室溫下收集初羽化的BtTRP基因突变品系（显微注射sgRNA和 化s9mRNA混合液诱导形成的突变型烟粉風）（<化)于离屯、管，每管一头，在显微镜下观察并 区分雌雄，进行分组并记录，作为基因突变品系的亲本F0代，"培育方法"同实施例1。同理， 收集初羽化的野生型烟粉風（<化)于PCR管，每管一头，在解剖镜下观察并区分雌雄，进行 分组并记录，作为野生型F0代，"培育方法"同实施例1。
[0047] (2)杂交F1代的获得:将辨明雌雄并分组的F0代烟粉風按照表1的组合进行杂交 后，放置于棉花上产卵3天，产卵后的棉花置于人工气候箱内饲养(溫度为26±rc，相对湿 度60-80%，光周期为16L:8D)e3天后，收集烟粉風于PCR管。每个组合5个重复，每个重复100 对成虫。培养25天左右，收集小于3天虫龄的烟粉風作为F1代。
[004引表1杂交组合处理
[0049]
[0050] (3)自交F2代的获得:收集F1代初羽化的烟粉風（<化)于PCR管，每管一头成虫，在 解剖镜下观察区分雌雄进行分组，在同一杂交组合的F1代中选取雌雄个体，放置于棉花上 产卵3天，产卵后的棉花置于人工气候箱内饲养(溫度为26±rC，相对湿度60-80%，光周期 为16L: 8D)。3天后，收集烟粉風于PCR管。每个组合5个重复，每个重复100对成虫。培养25天 左右，收集小于3天虫龄的烟粉風作为F2代。
[0051] (4)杂交后代高溫胁迫处理统计击倒时间：用吸虫器收集初羽化烟粉風成虫（< 化），放入PCR管，管口塞已消毒的脱脂棉团，每管1头成虫，分别编号。将装有烟粉風的PCR管 5个一组，同时插入漂浮板，将漂浮板置于由德国化ber溫度控制器（CC-106A,Germany， Huber Kiillcmaschinenbau GmbH)控溫的水浴槽内，溫度提前设置为恒溫45°C，保持液面与脱 脂棉团下端齐平，使整个PCR管腔体都浸没水中。在PCR管置于水浴槽内Imin后，开始计时， 观察管内烟粉風的活动状态，W烟粉風失去对身体的控制能力，无法自主站立作为热击倒 计时结束的标准，并将运段时间作为高溫击倒时间TKD化eat knockdown time)。
[0052] 如图1所示，不同杂交组合F2代烟粉風之间耐热性表型值差异，即观察高溫胁迫后 击倒时间。数据为均值±标准误，单个处理样本量为500头。小写字母表示耐热性存在显著 差异。(P<0.05)。
[0053] (5)杂交后代低溫胁迫处理统计恢复时间：用吸虫器收集初羽化烟粉風成虫（< 化），放入PCR管，管口塞已消毒的脱脂棉团，每管1头成虫，分别编号。将装有烟粉風的PCR管 10个一组，同时插入塑料泡沫制成的漂浮板，将漂浮板置于由德国化ber溫度控制器(撕- 106A, Germany,化ber Kiii化m化chincnbauGmbH)控溫的内置溫控腔体内，腔体内溫度提前设 置恒溫于-5°C，保持液面与脱脂棉团下端齐平，使整个PCR管腔体浸没水中，并将低溫腔体 盖严。在PCR管置于水浴槽内lOmin后，迅速将其取出，擦干管壁上的水，置于室溫26°C环境 下，开始计时。观察管内烟粉風的活动状态，W烟粉風逐渐恢复对身体的控制能力，能够自 主站立作为冷击倒恢复计时的标准，将运段时间作为冷致昏恢复时间TRC(chillcoma recovery time)。
[0054] 如图2所示，不同杂交组合F2代烟粉風之间耐寒性表型值差异，即观察低溫胁迫后 恢复时间。数据为均值±标准误，单个处理样本量为500头。小写字母表示耐热性存在显著 差异（P<0.05)。
【主权项】
1. 一种获得CRISPR/Cas9系统诱导的烟粉虱MED隐种BtTRP基因突变系的方法，其特征 在于，所述方法包括以下步骤： (1) BtTRP基因突变品系的获得，包括以下步骤： (1 -1) BtTRP基因 sgRNA引物的设计： 基于烟粉虱MED隐种的BtTRP基因序列，设计sgRNA的靶标位点，引物序列如下： MED-F： GAAATTAATACGACTCACTATAGGACCAGGAGAGAGGCAAACTCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC； sgRNA-R： AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCT CTAAAAC， (1-2)合成 BtTRP 基因 sgRNA， (1-3)合成〇3891111?熟， (1 -4)显微注射，将步骤（1 -2)获得的BtTRP基因 sgRNA和步骤（1 -3)获得的Cas9mRNA混 合，摩尔比为2:1，注射至烟粉虱MED隐种红眼期伪蛹，培育获得BtTRP基因突变品系； (2) 获得亲本FOR; (3) 获得杂交FIR; (4) 获得自交F2代； (5) 高温胁迫检测，及低温胁迫检测，获得稳定的烟粉虱MED隐种BtTRP基因突变系。2. 根据权利要求1所述的获得CRI SPR/Cas9系统诱导的烟粉虱MED隐种BtTRP基因突变 系的方法，其特征在于，在步骤（1-4)中，注射后的烟粉虱MED隐种红眼期伪蛹的培育条件 为:温度为26±1°C，相对湿度60-80%，光周期为16L:8D。
【文档编号】C12N15/89GK106047936SQ201610417540
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月12日
【发明人】吕志创, 王原, 刘万学, 万方浩
【申请人】中国农业科学院植物保护研究所