一种通过厌氧氨氧化细菌生产联氨的方法
【专利摘要】本发明公开了一种通过厌氧氨氧化细菌生产联氨的方法，该方法包括将厌氧氨氧化细菌接入含有一氧化氮、氨氮和无机废水的培养液中进行培养的培养步骤。该方法利用了一氧化氮能被厌氧氨氧化细菌同时吸收产联氨并且一氧化氮又能抑制联氨不被进一步转化为氮气的双重特性，达到通过厌氧氨氧化细菌同时吸收一氧化氮和氨氮稳定产联氨的目的，是一种更具应用前景的微生物产联氨方法。本发明中使用的方法简单，材料廉价易得，非常适合环境微生物、环境保护和环境能源行业的广泛应用，并有利于工业化生产。
【专利说明】
-种通过厌氧氨氧化细菌生产联氨的方法
技术领域
[0001] 本发明属于厌氧氨氧化脱氮和环境能源领域，设及一种通过厌氧氨氧化细菌同时 吸收一氧化氮和氨氮生产联氨的方法。
【背景技术】
[0002] 联氨是一种重要的化工原料，广泛应用于医药、农业、化工甚至军工产业。目前的 联氨合成产业存在技术路线落后、污染大、成本高等缺点，因此联氨的安全生产工艺研究具 有十分重要的理论和实践意义。厌氧氨氧化细菌是一种新型的脱氮菌，但是长期的研究发 现，厌氧氨氧化反应过程中也会产生中间产物联氨，但是之后会被很快进一步降解为氮气， 因此如何将厌氧氨氧化过程抑制在联氨的阶段成为了研究热点。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种通过厌氧氨氧化细菌持续产联氨的方法，该方法利用了 一氧化氮能被厌氧氨氧化细菌吸收产联氨同时又能抑制联氨不被进一步转化为氮气的双 重特性，达到通过厌氧氨氧化细菌同时吸收一氧化氮和氨氮稳定产联氨的目的，是一种更 具应用前景的微生物产联氨方法。
[0004] 本发明的技术方案如下：
[0005] -种通过厌氧氨氧化细菌生产联氨的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤:将 厌氧氨氧化细菌接入含有一氧化氮、氨氮和无机废水的培养液中进行培养的培养步骤。
[0006] 进一步地，在上述技术方案中，所述培养液中络合一氧化氮的浓度为1~25mM，最 优选为lOmM，游离态一氧化氮曝气流速为5~40mL/min，最优选为20mL/min。
[0007] 进一步地，在上述技术方案中，所述厌氧氨氧化细菌来源于厌氧氨氧化污泥。即， 在所述培养步骤中，将厌氧氨氧化污泥接入所述培养液中进行培养。
[000引进一步地，在上述技术方案中，所述厌氧氨氧化污泥的MLVSS = 3000~4000mg/L。
[0009] 进一步地，在上述技术方案中，所述培养的培养溫度为34~36°C，培养时间为4~ 2地，培养液的抑值为7.0~8.0。
[0010] 进一步地，在上述技术方案中，所述一氧化氮为络合态的一氧化氮或气体游离态 的一氧化氮。络合态的一氧化氮采用将一氧化氮通入邸TA溶液按照1:1络合获得。
[0011] 进一步地，在上述技术方案中，该方法还包括如下步骤：
[0012] (1)所述培养步骤结束后，回收厌氧氨氧化细菌，接入含有氨氮、亚硝氮和无机废 水的培养液A中培养，培养溫度为％~36°C，培养时间为12~48h，培养液的pH值为7.0~ 8.0，培养结束后回收厌氧氨氧化细菌；
[0013] (2)将步骤(1)中回收的厌氧氨氧化细菌接入含有一氧化氮、氨氮和无机废水的培 养液B中培养，培养溫度为34~36°C，培养时间为4~2地，培养液的pH值为7.0~8.0。
[0014] 进一步地，在上述技术方案中，在步骤(1)中，所述的培养液A中氨氮的浓度为90~ llOmg/L，亚硝氮的浓度为120~140mg/L。
[0015] 进一步地，在上述技术方案中，在步骤（1)中，所述培养液中一氧化氮的浓度为1~ 25mM，最优选为1 OmM，游离态一氧化氮曝气流速为5~40mL/min，最优选为20mL/min。
[0016] 进一步地，在上述技术方案中，所述厌氧氨氧化细菌来源于厌氧氨氧化污泥，所述 厌氧氨氧化污泥的MLVSS = 3000~4000mg/L。
[0017] 本发明的技术方案中，所述的无机废水的大量元素和微量元素浓度不予限定，可 W使用本领域中培养厌氧氨氧化污泥时使用的通用培养基中所含的组分和浓度。
[0018] 本发明的技术方案中，联氨的生产过程氨氮的浓度不予限定，优先采用50mg/L。细 菌活性恢复过程中，优先的，畑4+的浓度为90~110mg/L，N〇2前浓度为120~140mg/L。
[0019] 本发明提供的方法与现有技术相比，具有W下优点：
[0020] (1)本发明提供了一种全新的微生物方法用于稳定、持续产联氨。
[0021] (2)本发明利用NO能够抑制厌氧氨氧化菌体内联氨脱氨酶的活性将厌氧氨氧化反 应控制在联氨的阶段，结合了厌氧氨氧化细菌既能去除污染物质一氧化氮和氨氮还能产生 中间产物联氨的双重特性。
[0022] (3)本发明的方法简单，材料廉价易得，非常适合环境微生物、环境保护行业W及 能源行业的广泛应用，并有利于工业化生产。
【附图说明】
[0023] 图1为序批式实验厌氧氨氧化细菌消耗络合一氧化氮的联氨产量图；
[0024] 图2为络合一氧化氮抑制厌氧氨氧化细菌之后的恢复图；
[0025] 图3为细菌恢复之后继续消耗络合一氧化氮的联氨产量图；
[0026] 图4为序批式实验厌氧氨氧化细菌消耗游离一氧化氮的联氨产量图；
[0027] 图5为游离一氧化氮抑制厌氧氨氧化细菌之后的恢复图；
[0028] 图6为细菌恢复之后继续消耗络合一氧化氮的联氨产量图。
【具体实施方式】
[0029] 下述非限制性实施例可W使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不W 任何方式限制本发明。下述实施例中所述试验方法，如无特殊说明，均为常规方法;所述试 剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0030] 下述实施例中联氨的生成量用Premkumar等描述的方法检测（Thermochimica Acta 386(1) ;2002)，NH/-N和N02^N含量分别采用纳氏试剂法(GB7479-87)和离子色谱法 方法检测（ICS-1100，DI0肥X，AR，USA)。
[0031] 实施例1
[0032] 在本例中，添加的一氧化氮是络合态一氧化氮，厌氧氨细菌产联氨的过程主要分 为=个阶段，即细菌产联氨-细菌活性恢复-细菌恢复后继续产联氨=个阶段。
[0033] 第一个阶段，首先通过序批式实验考察添加的络合一氧化氮浓度和产联氨量的关 系。首先一氧化氮气体先通入FeS〇4-抓TA溶液中形成络合N0-EDTA溶液。之后采用6个70mL 具塞血清小瓶中分别加入氨氮、络合一氧化氮、无机废水。所述无机废水为常规的培养厌氧 氨氧化细菌的大量元素和微量元素的混合溶液。具体组成如表1和表2。保持氨氮浓度为 50mg/L，氨氮的来源为市场上购买的硫酸锭配置而成。大量元素和微量元素按表1和表2配 置，加入2g厌氧氨氧化污泥(MLVSS = 3920mg/L。控制小瓶中溶液化= 7.0，D0<0.5mg/L，络合 一氧化氮的浓度梯度分别为1、5、10、15、20、25mM，在水溫为35 ± rC的水浴摇床中反应12小 时，检测联氨的生成量，结果如图1。图1可见，当络合一氧化氮浓度为lOmM时，联氨的生成量 在第8小时达到最大，最大值达到了 779祉g/L，随着时间的继续延长，联氨量不再继续增长， 甚至当继续增加一氧化氮的浓度的时候，联氨产量会下降，运是因为随着时间的延长或者 是增加一氧化氮的浓度增加，一氧化氮本身对厌氧氨氧化细菌的活性产生了严重的抑制作 用。当一氧化氮浓度小于lOmM时，联氨产量也会下降运是因为一氧化氮对菌体内联氨脱氨 酶的抑制作用减弱之后部分联氨被直接转化成了氮气。综上所述，当厌氧氨氧化污泥的 MLVSS浓度为3920mg/L时，添加的络合一氧化氮浓度为lOmM时，联氨产量最大，最大值为 779祉g/L。培养结束后，分别收集6个具塞血清小瓶中的厌氧氨氧化污泥，备用。
[0034] 第二个阶段，是细菌活性的恢复阶段。采用7个120mL的具塞血清瓶加入50mL氨氮 和亚硝氮浓度为lOOmg/L和130mg/L，大量元素和微量元素按表1和表2配制的无机废水，第 一个小瓶内放入2g厌氧氨氧化污泥(MLVSS = 3920mg/L)，后六个小瓶内分别对应放入第一 阶段的污泥，控制小瓶中溶液PH= 7.0，00<0.5mg^，最后在水溫为35 ± rC的水浴摇床中反 应，每8小时换一次人工配置的无机废水，通过检测NH/-N和N02^-N的减少量来衡量厌氧氨 氧化细菌的活性，如图2。图2结果可见，经过一段时间的恢复之后细菌均能恢复之前的活 性。其中，原加入络合一氧化氮浓度为lOmM的恢复时间大约为2地。培养32h后，分别收集7个 具塞血清小瓶中的厌氧氨氧化污泥，备用。
[0035] 第=阶段为污泥活性恢复之后产联氨阶段，实验方法与第一个阶段一样，6个小瓶 内对应放入恢复之后的厌氧氨氧化污泥，络合一氧化氮的浓度梯度同样为1、5、10、15、20、 25mM。实验发现，经过恢复之后的细菌同样具有产联氨的能力，细菌活性恢复之后加入lOmM 络合一氧化氮后联氨最大产量为7527yg/L，与第一阶段差别不大，结果如图3。
[0036] 表1.无机废水中大量元素的组成
[0040] 实施例2
[0041] 在本例中，通入的一氧化氮是游离态气体一氧化氮，厌氧氨细菌产联氨的过程同 样分为=个阶段，即细菌产联氨-细菌活性恢复-细菌恢复后继续产联氨=个阶段。
[0042] 第一个阶段，首先通过序批式实验考察游离态气体一氧化氮流速和产联氨量的关 系。采用6个70mL具塞血清小瓶中分别加入氨氮、无机废水。所述无机废水为大量元素和微 量元素的混合溶液。保持氨氮浓度为50mg/L，大量元素和微量元素按表1和表2配置，加入2g 厌氧氨氧化污泥(11^￥55 = 3000-4000111旨/1)，控制小瓶中溶液化=7.0，放置在水溫为35±1 °C的水浴摇床中，不断通入一氧化氮和氮气的混合气体(2%)，气体流速分别为5、10、15、 20、30、40mL/min反应12小时，之后检测联氨的生成量，结果如图4。图4可见，当混合气体流 速为20mL/min时，联氨的生成量最大达到了 1200化g/L，增大或者减少一氧化氮的流速，联 氨产量同样会下降。综上所述，当厌氧氨氧化污泥的MLVSS浓度为3920mg/L时，一氧化氮含 量2 %的混合气体流速为20mL/min时，联氨产量最大，最大值为1200化g/L。培养结束后，分 别收集6个具塞血清小瓶中的厌氧氨氧化污泥，备用。
[0043] 第二个阶段，为厌氧氨氧化细菌的活性恢复阶段。操作方法与实例1第二个阶段类 似，实验发现经过游离一氧化氮抑制后的厌氧氨氧化细菌活性经过一段时间的培养同样能 够恢复，结果如图5。图5可见，混合一氧化氮气体流速为20mL/min产联氨之后的恢复时间也 为2地。培养2地后，分别收集7个具塞血清小瓶中的厌氧氨氧化污泥，备用。
[0044] 第=个阶段为细菌活性恢复之后的产联氨阶段，实验方法与第一个阶段一样，6个 小瓶内对应放入恢复之后的厌氧氨氧化污泥，按照比例分别加入氨氮、无机废水，调节溶液 pH值为7.0，然后不断通入一氧化氮和氮气的混合气体(2% )，气体流速分别为5、10、15、20、 30、40mL/min，连续通入12小时，检测联氨的生成量，结果如图6。图6可见，经过游离一氧化 氮恢复之后的细菌恢复之后同样能够继续产联氨，恢复之后的联氨产量最大达到1225化g/ L，同样与第一阶段产量区别不大。
[0045] 综上所述，无论是实例1还是实例2,厌氧氨氧化都能在消耗氨氮和一氧化氮的基 础上实现稳定的产联氨，尽管由于一氧化氮对细菌会有抑制作用，但是运种抑制作用是可 逆的，经过短暂恢复之后即可稳定的实现厌氧氨氧化细菌产联氨。
【主权项】
1. 一种通过厌氧氨氧化细菌生产联氨的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤:将厌 氧氨氧化细菌接入含有一氧化氮、氨氮和无机废水的培养液中进行培养的培养步骤。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养液中一氧化氮的浓度为1~25mM。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述厌氧氨氧化细菌来源于厌氧氨氧化污 泥。4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述厌氧氨氧化污泥的MLVSS = 3000~ 4000mg/L〇5. 根据权利要求1~4的任一项所述的方法，其特征在于，所述培养的培养温度为34~ 36°C，培养时间为4~24h，培养液的pH值为7.0~8.0。6. 根据权利要求1~4的任一项所述的方法，其特征在于，所述一氧化氮为络合态的一 氧化氮或气体游离态的一氧化氮。7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法还包括如下步骤： (1) 所述培养步骤结束后，回收厌氧氨氧化细菌，接入含有氨氮、亚硝氮和无机废水的 培养液A中培养，培养温度为34~36°C，培养时间为12~48h，培养液的pH值为7.0~8.0，培 养结束后回收厌氧氨氧化细菌； (2) 将步骤(1)中回收的厌氧氨氧化细菌接入含有一氧化氮、氨氮和无机废水的培养液 B中培养，培养温度为34~36°C，培养时间为4~24h，培养液的pH值为7.0~8.0。8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤（1)中，所述的培养液A中氨氮的浓 度为90~110mg/L，亚硝氮的浓度为120~140mg/L。9. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述的培养液B中一氧化氮 的浓度为1~25mM。10. 根据权利要求7~9的任一项所述的方法，其特征在于，所述厌氧氨氧化细菌来源于 厌氧氨氧化污泥，所述厌氧氨氧化污泥的MLVSS = 3000~4000mg/L。
【文档编号】C12P3/00GK106047937SQ201610390730
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月3日
【发明人】乔森, 尹鑫, 田天, 金若菲, 周集体
【申请人】大连理工大学