一株宿主细胞及其应用
【专利摘要】本发明提供一株宿主细胞，其为中国仓鼠卵巢细胞CHO?K1?S2?HSA，将其进行保藏，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：武汉市武汉大学，保藏编号：CCTCC C2015171，保藏日期：2015年11月5日。本发明的宿主细胞能高效分泌表达重组人血白蛋白。培养后，HSA表达量达150?180mg/L。细胞培养条件简单，成本低。CCTCC C201517120151105
【专利说明】
一株宿主细胞及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一株宿主细胞及其应用。
【背景技术】
[0002] 人血白蛋白（HSA)是人血浆中最丰富的蛋白质，占血浆总蛋白的40%-60%，在体内 起着维持血浆胶体渗透压、运输营养等重要作用。人血白蛋白临床上主要用于失血创伤、烧 伤引起的休克、脑水肿及损伤引起的颅压升高、肝硬化及肾病引起的水肿或腹水;在心肺分 流术、烧伤的辅助治疗、血液透析的辅助治疗及成人呼吸窘迫综合征中也有广泛应用，是医 院临床急救或重症手术的必备药品，在医院市场一直占据举足轻重的地位。人血白蛋白通 常由血浆提取。由于浆站改制及血液制品安全监管力度的加强等诸多因素的影响，国内市 场以人血白蛋白为代表的血液制品供应严重短缺，供需矛盾问题突出。采用基因工程方法 生产重组人血白蛋白具有原料来源丰富、质量可控、可形成规模化生产等优点，同时可以彻 底消除病毒污染危险，对于缓解国内人血白蛋白供不应求的局面、消除血源产品的安全风 险具有十分重要的社会意义和经济意义，具有广阔的发展空间和市场前景。
【发明内容】
[0003] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一株高效分泌表达重组人血白蛋 白的宿主细胞。
[0004] 本发明提供一株宿主细胞，其为中国仓鼠卵巢细胞CH0-K1-S2-HSA，将其进行保 藏，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址:武汉市武汉大学，保藏编号： CCTCC C2015171，保藏日期：2015年 11 月5日。
[0005] 本发明还提供上述宿主细胞在分泌表达重组人血白蛋白中的应用。
[0006] 作为优选，所述重组人血白蛋白的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.2。
[0007] 作为优选，所述分泌表达重组人血白蛋白是将CH0-K1-S2-HSA CCTCC C2015171接 种，于37 ± 1°C、50mL/L C〇2、120 ± 30rmp条件下培养3-6天后，再于32 ± 2 °C、50mL/L C〇2、120 ± 20rmp继续培养。
[0008] 作为优选，所述接种的接种量为3 X 105cells/mL~8 X 105cells/mL。
[0009] 作为优选，所述分泌表达重组人血白蛋白是将中国仓鼠卵巢细胞CH0-K1-S2-HSA CCTCC C2015171 以3X105cells/mL~8X105cells/mL的细胞量接种，培养基为Hyclone 公 司的SFM4CH0培养基，于37 ± 1°C、50mL/L C〇2、120 ± 30rmp条件下培养3-6天后，再于32 ± 2 Γ、50mL/L C〇2、120 ± 20rmp继续培养6天。
[0010] 作为优选，所述分泌表达重组人血白蛋白是将CH0-K1-S2-HSA CCTCC C2015171接 种，在溶氧量50%、pH7.2及转速lOOrpm的培养条件下，采用流加的方式进行培养。
[0011] 更优选地，所述接种的接种量为5 X 105cells/mL~8 X 105cells/mL。
[0012] 更优选地，所述培养时的培养温度为37 ± 1°C。
[0013] 更优选地，所述培养时的培养基为SFM4CH0培养基。
[0014] 本发明的宿主细胞能高效分泌表达重组人血白蛋白。培养后HSA表达量达150-180mg/L。细胞培养条件简单，成本低。
【附图说明】
[0015] 附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实 施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中： 图1为重组质粒PCDNA3. ι-HSA的酶切结果； 图2为重组质粒pcDNA3.1-HSA转染CH0-K1-SFS细胞后的Western blot检测结果，其中Μ 为Marker，1为转染后24h上清，2为转染后48h上清； 图3为HSA标准曲线； 图4为CH0-K1-S2-HSA细胞的冻存与复苏分析，其中1为CH0-K1-S2-HSA复苏后第3代;2 为CH0-K1-S2-HSA复苏后第4代；3为CH0-K1-S2-HSA复苏后第5代;4为CH0-K1-S2-HSA冻存 前；5 为HSA标准品（S i gma ) 100yg/mL，Μ为Mar ker; 图5为CH0-K1-S2-HSA细胞在传代过程中白蛋白含量检测结果;其中1为CH0-K1-S2-HSA 第 14代；2为CH0-K1-S2-HSA 第 13代；3为CH0-K1-S2-HSA 第 12代；4为CH0-K1-S2-HSA 第 10代;5为CH0-K1-S2-HSA 第5代;6为CH0-K1-S2-HSA 第0代;7为HSA标准品(Sigma) 10yg/ ml变性样品；8为HSA标准品（Sigma)10μg/ml非变性样品;Μ为Marker; 图6为CH0-K1-S2-HSA细胞加与不加 G418时，上清中的白蛋白含量分析；其中Μ为 Marker;l为CH0-K1-S2-HSA 加 G418第1代；2为CH0-K1-S2-HSA 无 G418第1代；3为CH0-K1-S2-HSA 加 G418第2代;4为CH0-K1-S2-HSA 无 G418第2代;5为CH0-K1-S2-HSA 加 G418第3代； 6为CH0-K1-S2-HSA 无 G418第3代;7为CH0-K1-S2-HSA 加 G418第5代;8为CH0-K1-S2-HSA 无 G418第5代； 图7为CH0-K1-S2-HSA细胞上清冻干后的白蛋白检测，其中Μ为Marker; 1为冻干lmg/mL; 2 为冻干 10mg/mL;3 为冻干 100mg/mL;4 为冻干500mg/mL; 图8为CH0-K1-S2-HSA细胞的生长曲线。
【具体实施方式】
[0016] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市 售。
[0017] 实施例！ 一、人血白蛋白哺乳动物真核表达载体的构建 1、人血白蛋白（HSA)基因的获得 在GENBANK、G00GLE学术等查询有关HSA相关信息及文献资料，HSA基因登录号：NM_ 000477.5〇
[0018] 前原白蛋白共609个氨基酸，登录号为NP_000468.1，其中前24个编码信号肽（引导 新合成的蛋白质向分泌通路转移的短肽链(长度5-30个氨基酸）。
[0019] 2、重组表达载体pcDNA3.1-HSA的构建 根据哺乳动物细胞密码子偏好性，主要针对CH0细胞进行密码子优化，上游插入I 酶切位点，下游插入ΧΑο頂每切位点，并在I酶切位点后加入Kozak序列，目的基因全长 1845bp，由上海生工生物技术有限公司合成。合成的具体核苷酸序列如下： GGTACC^CC^CCATGAAGTGGGTCACCTTTATCTCTCTCCTGTTCTTGTTCAGCTCTGCATACTCCCGTGGTG TGTTCCGCAGGGACGCTCATAAATCTGAGGTGGCTCACAGGTTCAAGGACCTGGGCGAAGAGAACTTTAAAGCTCTC GTACTCATCGCATTCGCTCAGTACTTGCAGCAGTGTCCCTTTGAGGACCACGTGAAACTGGTGAACGAGGTAACCGA ATTTGCCAAAACATGCGTGGCCGATGAGAGTGCAGAGAATTGTGATAAGTCCTTGCATACCCTCTTCGGTGACAAGC TGTGTACAGTCGCCACTCTGAGGGAAACATATGGGGAGATGGCAGATTGCTGCGCCAAACAGGAACCTGAACGAAAC GAGTGTTTTCTGCAGCACAAGGACGATAATCCAAATTTGCCCCGTCTGGTTAGACCCGAGGTGGACGTGATGTGCAC CGCATTTCATGACAACGAGGAAACCTTCCTGAAGAAATACCTCTACGAAATCGCCCGACGTCACCCCTATTTTTACG CTCCCGAGCTTCTGTTCTTTGCCAAGAGATACAAAGCAGCTTTTACCGAATGCTGTCAGGCCGCCGATAAAGCCGCC TGTTTGTTGCCAAAGCTTGACGAACTGAGAGATGAGGGCAAGGCATCCTCCGCAAAACAACGGCTGAAATGTGCCAG CTTGCAAAAGTTCGGGGAACGCGCCTTCAAAGCATGGGCAGTGGCAAGGCTCAGTCAACGGTTCCCCAAAGCCGAGT TTGCAGAGGTATCCAAACTTGTCACTGATCTTACTAAGGTTCATACTGAGTGTTGTCACGGAGATCTTCTTGAGTGC GCTGACGACCGGGCCGATCTCGCCAAGTATATCTGCGAGAACCAGGACTCAATTAGCAGTAAGCTGAAGGAGTGTTG CGAAAAGCCACTGCTGGAAAAATCCCACTGTATAGCCGAGGTAGAAAATGATGAGATGCCAGCCGACCTTCCTAGCC TCGCTGCTGATTTCGTGGAATCAAAAGATGTCTGCAAGAACTATGCCGAAGCCAAGGACGTGTTTCTCGGTATGTTT CTGTACGAATACGCTCGCCGACACCCAGATTATAGTGTCGTCCTGCTCCTGCGCCTCGCTAAGACATACGAGACTAC ATTGGAAAAGTGTTGTGCCGCCGCAGACCCCCATGAGTGCTATGCTAAGGTCTTTGATGAGTTCAAGCCTCTGGTTG AGGAGCCTCAGAACCTCATTAAGCAGAATTGCGAACTGTTCGAGCAGCTGGGCGAGTATAAGTTCCAGAACGCATTG CTTGTTCGCTATACTAAGAAAGTTCCTCAGGTGTCTACTCCTACACTTGTGGAGGTGTCCCGGAATCTGGGCAAGGT AGGAAGCAAATGCTGCAAACACCCCGAGGCTAAACGGATGCCATGTGCAGAGGATTATCTTTCAGTGGTTCTGAATC AACTGTGCGTGCTGCATGAAAAAACCCCAGTGTCAGACAGAGTTACCAAGTGCTGCACCGAGAGCCTGGTCAATAGG CGACCTTGCTTCAGCGCTCTGGAAGTGGATGAGACTTACGTGCCTAAGGAATTCAACGCTGAGACATTCACCTTTCA TGCCGACATTTGCACATTGTCTGAGAAAGAGAGACAGATCAAGAAACAGACCGCTCTGGTGGAACTCGTGAAGCACA AACCCAAGGCTACAAAGGAGCAGTTGAAGGCTGTTATGGACGACTTTGCCGCTTTTGTCGAAAAGTGCTGTAAGGCT GATGACAAGGAGACATGTTTCGCCGAAGAAGGAAAGAAGCTGGTCGCAGCCTCTCAAGCTGCCCTCGGGCTGCTCGA 殳。
[0020] 其中下划线分别为Κρη I和Xho頂每切位点，斜体为Kozak序列。
[0021]设计一套引物： 上游FI: GGTACCGCCACCATGAAGTGGGTCACC; 下游 R1: CTCGAGCAGCCCGAGGGCAGCTTG 〇
[0022]以合成的基因为模板，用F1/R1为引物扩增（1845bp)，PCR反应体系为dNTPs(lOmM) 18.5yL，10XPCR 缓冲液 2.5yL，Fl(25mM) 0.5yL，Rl(25mM) 0.5yL，Taq DNA聚合酶0.5yL， 模板基因2yL，加ddH20补至25yL。反应条件94°C预变性5min;94°C变性30s，61°C退火45s， 72°C延伸60s，共循环35次;72°C延伸10min，4°C保存。
[0023]将PCR产物与pUC57载体于16°C连接2h，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，并涂布氨 苄青霉素抗性LB平板。37°C恒温培养12-15h后，挑取单一菌落接种于含50mg/L的Amp+的LB 液体培养基中，37°C 200rpm振荡培养8h后提取质粒，由上海生工生物技术有限公司进行测 序。测序正确的质粒命名为PUC57-HSA。
[0024] 用你/3 1+觅〇 I分别双酶切pUC57-HSA质粒和pcDNA3.1载体片段，凝胶纯化回收后 用T4 DNA连接酶于16°C连接过夜，次日将连接产物转化BL21感受态细胞，并涂布含Amp+的 LB平板，37°C培养约15h后，随机挑取5个单克隆菌斑加入含50mg/L的Amp+的LB液体培养基 中，37°C 200rpm振荡培养8h后提取质粒，用Ι+ΖΑο I进行酶切鉴定。酶切鉴定结果参见 图1，与预期相符（1845bp，5428bp)。双酶切鉴定为阳性的质粒由上海生工生物技术有限公 司进行测序。核苷酸序列参见序列表SEQ ID No. 1。
[0025] 测序：由TAKARA测序，并与Genbank中的标准人血清白蛋白序列（NP_000468.1) blast比对，氨基酸序列同源性为100%。氨基酸序列参见序列表SEQ ID No.2。
[0026] 将测序鉴定正确的pcDNA3.1-HSA质粒转化大肠杆菌后用OMEGA公司的去内毒素质 粒小提试剂盒重新提取，取10yL重组质粒10倍稀释后用分光光度计测定〇D 26Q/28Q，以1.8-2.0为宜，其余质粒-20 °C分装保存。
[0027] 3、批培养CH0-K1-S2-HSA C0细胞的制备 3.1 CH0-K1-SFS细胞的复苏及传代 复苏无血清全悬浮CH0-K1-SFS细胞(本实验室驯化的无血清全悬浮CH0-K1-SFS细胞， 见《中国生物制品学杂志》2014年2月第27期第2期《无血清悬浮培养CH0-K1-SFS细胞系的建 立及其生物学特性》），传代3-5代。
[0028] 细胞复苏:从液氮罐中取出1支冻存的无血清全悬浮CH0-K1-SFS细胞，立即放入37 °C的温水中快速晃动，直至完全溶解。然后900rpm离心10min，弃去上清，细胞中加入20mL 的无血清SFM4CH0培养基（Hyc 1 one公司的SFM4CH0培养基），于37 °C、50mL/LC〇2 120rpm培 养。24h后补加20mL的SFM4CH0培养基，继续37 °C、50mL/LC〇2 120rpm培养。
[0029] 细胞传代:48h后取lmL细胞悬液稀释后进行台盼蓝计数和计算细胞活力。取出部 分细胞加入新鲜的SFM4CH0培养基，使得最终的细胞密度为5 X 105cel 1 s/mL，37 °C、50mL/ LC02 120rpm继续培养。48h后同上进行传代，如此直至细胞活力彡95%后方能进行转染。 800rpm离心15min收集此时的细胞上清，0.22μπι的滤膜过滤，命名为旧SFM培养基，-20°C分 装保存，用于细胞冻存液的配制。
[0030] 3.2 转染 待细胞活力彡95%时，利用脂质体转染或电转染将pcDNA3.1-HSA质粒转染CH0-K1-SFS 细胞，24h、48h后分别收集细胞上清，利用Western blot检测有白蛋白表达。检测结果参见 图2。
[0031 ] (1)脂质体转染:使用Invitrogen公司的1^口(^6(^3111；[1162_进行转染，按照说明书 进行操作。具体如下： 取出lmL悬浮细胞进行细胞计数，确定细胞密度和活力，细胞活力多95%方可进行电转。 取总数为1-2 X 106cells/组细胞转移至离心管中，室温下800rpm离心10min，弃去上清。细 胞中加入2mL的opti-MEM重悬细胞，800rpm离心10min，弃去上清。如此重复清洗细胞2次，然 后加入2mL的opti-MEM轻轻混勾后加入6孔板中。
[0032] 转染复合物：①将4yg pcDNA3.1-HSA稀释于250yL opti-MEM 中；②将 10yL Lipofectamine2000稀释于250yL opti-MEM中，轻轻混匀，室温孵育5min。③将步骤①的混 合液逐滴加入步骤②的混合液中，并轻轻混匀，室温孵育20min。
[0033] 20min后，将转染复合物加入至6孔板中的细胞中，轻轻摇匀。37°C、50mL/L C02静 置培养。5h轻轻弃去上清，加入2mL无血清SFM4CH0培养基，37°C 50mL/L C02静置培养。
[0034] (2 )电转染:转染前一天，将细胞传代，保证实验当天细胞生长至对数生长期，悬浮 细胞密度约在l_2X106cells/mL。电转:使用L0NZA公司的4D-Nucleofector?电转仪。
[0035]实验前准备:将试剂盒取出放置于室温中约30min;加培养基（不含抗生素）到6孔 板中，每孔1.5mL，放于37°C、50mL/LC02培养箱预热。取出lmL悬浮细胞进行细胞计数，确定 细胞密度和活力，细胞活力多95%方可进行电转。取总数为l-2X10 6cellS/组细胞转移至离 心管中，室温下800rpm离心10min，弃去上清。
[0036]配置电转缓冲液：82yL Nuclefector? Solution+18yL Supplement，轻轻吹打混 匀。用电转缓冲液重悬细胞，使其形成单细胞悬液(注：电转缓冲液为现用现配，电转缓冲液 重悬细胞后应尽快电转，同时切忌气泡）。将l〇yg重组质粒PCDNA3.1-HSA加至上述细胞悬液 中，轻轻混匀。迅速转移至电转杯中，选择程序DT133进行细胞的电转。电转完成后取出预热 的培养基，用pipettes吸取约500yL加入电转杯中混合细胞2-3次，然后再用pipettes将电 转杯中的所有悬液吸出加入对应的6孔板中，如此重复2-3次，至37 °C、50mL/L C02培养箱中 静止培养。
[0037] Western blot检测:配制12%SDS_PAGE分离胶，分别收集转染前和转染后的细胞上 清进行SDS-PAGE电泳。然后将蛋白条带在低温、恒压60V转印至PVDF膜，2h后取出膜用5%的 脱脂奶粉室温摇床封闭2h，加入1:150的自制的兔抗pHSA IgG-HRP，室温摇床孵育2h，经 PBST充分洗涤后进行DAB显色。
[0038] 3.3加药筛选 转染完成后将细胞置于6孔板中静止培养，24h后加400yg/mL的G418进行持续的筛选和 细胞传代，此过程中细胞一直于37 °C、50mL/L C02培养箱中静止培养。待细胞数目达到约8 X106时，将静止培养改为悬浮培养(37°C 50mL/L C02培养箱中120rpm)，细胞传代3~5代后， 细胞活力由最初的50%可提高到85%，最终得到批培养的CH0-K1-S2-HSA C0细胞。
[0039] (1)静止培养的细胞传代:转染24h后观察细胞形态又圆又亮。将6孔板中的1孔细 胞传至2孔，2mL/孔，加入终浓度为400yg/mL的G418 SFM4CH0筛选培养基进行培养。48h后每 孔中补加2mL培养基。再培养48h将6孔板中的1孔细胞传代至1个T25的细胞瓶中，10mL/瓶。 继续培养72h后将1个T25细胞瓶传代至1个T100的细胞瓶中，30mL/瓶。传代过程中维持G418 的终浓度为400yg/mL，细胞均置于37 °C、50mL/LC02培养箱中静置培养。
[0040] (2)由静止培养改为悬浮培养:取少量细胞进行计数，待细胞总数达到8 X 106时， 收集T100细胞瓶中的细胞，900rpm离心10min，将上清保存用于Western blot检测，细胞中 加入10mL新鲜的含400yg/mL G418的无血清SFM4CH0培养基，于37°C、50mL/LC〇2 120rpm培 养，此时细胞密度约为8X105cells/mL，活力约为50-70%。4811进行细胞计数和活力测定， 900rpm离心10min，将上清保存用于Western blot检测，细胞中加入适当的新鲜SFM4CH0培 养基，维持细胞密度在8X105cellS/mL左右。48h后同上进行传代，传代过程中维持G418的 终浓度为400yg/mL，细胞均置于37 °C、50mL/L C02培养箱中120rpm培养，直至细胞活力提高 到85%以上。
[0041 ] 4、第1次单克隆细胞CH0-K1-S2-HSA C1的获得 将批培养的CH0-K1-S2-HSA C0细胞计数后进行稀释至每孔5.5/11/22/44/88/176 cells单克隆培养(期间G418浓度维持在400μg/ml)，15天后观察有约200个单一克隆细胞及 50个两克隆的细胞，分别取克隆细胞上清进行Western blot检测。选择其中Western blot 检测条带最深的1株细胞进行放大培养(96孔板、24孔板、6孔板、细胞瓶、摇瓶），命名为CHO-K1-S2-HSA Cl，并将放大培养后的细胞进行冻存。
[0042]细胞冻存方法为:取lmL细胞进行计数。收集细胞，900rpm离心10min，收集上清用 于Western blot检测，细胞中加入适量的细胞冻存液(93%旧SFM培养基+7%DMS0)，混合均匀 后1.5mL/支分装，每支冻存管中的细胞数目不少于2X10 7cellS。先于4°C放置2h，然后-70 °C过夜，之后取出冻存管，移入液氮罐中进行长期保存。
[0043] 将CH0-K1-S2-HSA C1细胞以5X 105cells/mL的细胞量接种，平行接种3瓶。接种细 胞后，在培养第三天时，取上述细胞一瓶，进行计数和lOOOrpm离心10min收集细胞上清。在 接种第6天时，如上进行细胞计数和上清收集。然后将培养箱温度下调至32°C，继续培养3天 (共9天），进行细胞计数和上清收集。用Abeam公司的ELISA检测试剂盒检测（ab 108788 Albumin Human ELISA Kit)CH0-Kl-S2-HSA Cl细胞上清中的HSA含量。
[0044] 将试剂盒中的标准品进行倍比稀释后，绘制标准曲线（见图3)。根据标准曲线，计 算细胞上清中的HSA浓度(见表1)。
[0045] 表1不同培养时间下CH0-K1-S2-HSA C1细胞中的HSA含量
5、第2次单克隆细胞CH0-K1-S2-HSA的获得、鉴定及细胞建库 5.1 CH0-K1-S2-HSA C0第2次单克隆筛选 将第1次单克隆获得的CH0-K1-S2-HSA C1这株细胞进行再次单克隆，得到1株白蛋白表 达较强的细胞，将该细胞株命名为CH0-K1-S2-HSA。
[0046] 5.2 CH0-K1-S2-HSA细胞的ELISA检测 将CH0-K1-S2-HSA细胞以5X105cellS/mL的细胞量接种，平行接种3瓶。接种细胞后，在 培养第三天时，取上述细胞一瓶，进行计数和l〇〇〇rpm离心10min收集细胞上清。在接种第6 天时，如上进行细胞计数和上清收集。然后将培养箱温度下调至32°C，继续培养3天（共9 天），进行细胞计数和上清收集。用Abeam公司的ELISA检测试剂盒检测(abl08788 Albumin Human ELISA Kit)CH0-Kl-S2-HSA细胞上清中的HSA浓度，方法同CH0-K1-S2-HSA Cl(见表 2)〇
[0047] 表2不同培养时间CH0-K1-S2-HSA细胞中的HSA含量
检测结果发现，CH0-K1-S2-HSA Cl及CH0-K1-S2-HSA细胞中HSA的表达量均随着培养时 间的延长而增加，且每组中CH0-K1-S2-HSA的表达量均较CH0-K1-S2-HSA C1的表达量高，最 高可达为28.32mg/L。故仅进行CH0-K1-S2-HSA细胞培养条件的进一步优化。
[0048] 将CH0-K1-S2-HSA细胞放大培养至50ml摇瓶中，传代后建立主细胞库。并将该株细 胞中国仓鼠卵巢细胞CH0-K1-S2-HSA进行保藏，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)，保藏地址:武汉市武汉大学，保藏编号：CCTCC C2015171，保藏日期：2015年11月5 曰。
[0049] 取上述冻存的1支CCTCC C2015171细胞进行复苏，1200rpm离心10min，弃上清，细 胞中加入30mL含400yg/mLG418的SFM4CH0培养基中，37°C C〇2培养箱中120rpm振荡培养。 48h后补加20mL上述培养基。继续培养24h后将此瓶细胞传至3瓶，每瓶30mL。再培养48h后每 瓶中补加20mL上述培养基。再培养48h后以1:4进行传代，共计12瓶，50mL/瓶。培养约72h后 收集细胞，计数后进行冻存。建立工作细胞库。
[0050] 6 CHO-K1-S2-HSA细胞的鉴定 6.1冻存及复苏分析 将冻存的CHO-K1-S2-HSA复苏后进行Western blot检测，结果仍有白蛋白表达(见图 4)〇
[0051 ] 6.2传代分析 将CH0-K1-S2-HSA这株细胞放大至50ml摇瓶中，此时标记为CH0-K1-S2-HSA第0代。将 CH0-K1-S2-HSA第0代传代14代，至10代左右白蛋白含量略有下降(见图5)。
[0052] 6.3加与不加 G418分析 将CH0-K1-S2-HSA第0代分别传代5代，进行加与不加 G418上清白蛋白含量分析比较，结 果无明显差异(见图6)。
[0053] 6.4冻干样品中的白蛋白检测 将收集的2.5L CH0-K1-S2-HSA细胞上清进行冻干，共冻干约31.8g，分别用SFM4CH0培 养基溶解为lmg/mL、10mg/mL、100mg/mL及500mg/mL，进行Western blot检测，结果见图7。 注:因冻干时间太短，有部分样品未完全冻干。
[0054] 6.5生长曲线的绘制 复苏1支CH0-K1-S2-HSA细胞，按5.0 X 105cells/mL的密度传代，共接种三瓶细胞，培养 9天(37 °C、50mL/L C〇2、120rmp)，每天取500mL细胞培养液10倍稀释计数，三瓶细胞计数的 平均值为当天的细胞密度，图8为CH0-K1-S2-HSA细胞的生长曲线。
[0055] 7优化、稳定白蛋白表达的工艺流程及放大 7.1 CH0-K1-S2-HSA细胞培养条件的优化 将复苏后的CH0-K1-S2-HSA细胞以5X105cells/mL的细胞量接种至50ml摇瓶，做4个平 行，培养基为Hyclone公司的SFM4CH0培养基。第一组细胞37 °C、50mL/L C02、120rmp培养3 天，从第3天开始降温至32 °C，32 °C、50mL/L C02、120rmp继续培养7天;第二组为37 °C、50mL/ L C02、120rmp培养4天，32°C、50mL/L C02、120rmp继续培养6天；第三组为37°C、50mL/L C02、 120rmp培养5天，32°C、50mL/L C〇2、120rmp继续培养6天；第四组为37 °C、50mL/L C〇2、120rmp 培养6天，32 °C、50mL/L C02、120rmp继续培养4天。最后一天时进行细胞计数、收集上清进行 ELISA检测，结果见表3。
[0056] 表3 CH0-K1-S2-HSA细胞优化培养条件
虽然调整了降温时间，但总的培养时间未能延长，一般在培养第十天后开始出现大量 死亡，并且培养基开始粘稠浑浊，在第十一天或第十二天时，细胞基本全部死亡，限制了HSA 的表达。CH0-K1-S2-HSA细胞在第5天降温后表达量提高较多，可尝试在第5天降温后补加新 鲜培养基，这样HSA的表达量还会有提升的空间。
[0057] 7.2放大培养 将CH0-K1-S2-HSA细胞从50mL摇瓶进一步扩大培养至5L生物反应器中，人工监测培养 液中葡萄糖、谷氨酰胺及主要代谢物乳酸及氨的浓度变化，接种量为:5X105cells/mL~8 X 105cel 1 s/mL，培养条件为溶氧量50%、pH7.2及转速lOOrpm，培养温度为37 ± 1°C，培养基 为Hyc lone公司的SFM4CH0培养基，采用流加的方式进行培养，利用Abeam公司的ELISA试剂 盒进行检测，最终实现了 HSA的表达量为150-180mg/L。
[0058]最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明， 尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可 以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。 凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的 保护范围之内。
【主权项】
1. 一株宿主细胞，其为中国仓鼠卵巢细胞CH0-K1-S2-HSA，保藏编号为CCTCC C2015171〇2. 权利要求1所述的宿主细胞在分泌表达重组人血白蛋白中的应用。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于:所述重组人血白蛋白的氨基酸序列为序列 表中SEQ ID Νο·2。4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述分泌表达重组人血白蛋白是将CHO-K1-S2-HSA CCTCC C2015171 接种，于37±rC、50mL/L C〇2、120±30rmp条件下培养3-6天 后，再于32 ± 2 Γ、50mL/L C02、120 ± 20rmp继续培养。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于:所述接种的接种量为3 X 105cellS/mL~8 X 105cells/mL〇6. 根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于：所述分泌表达重组人血白蛋白是将中 国仓鼠卵巢细胞CH0-K1-S2-HSA CCTCC C2015171 以3X105cells/mL~8X105cells/mL的细 胞量接种，培养基为Hyclone公司的SFM4CH0培养基，于37 ± 1°C、50mL/L C02、120 ± 30rmp 条件下培养3-6天后，再于32 ± 2 °C、50mL/L C02、120 ± 20rmp继续培养6天。7. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述分泌表达重组人血白蛋白是将CH0-K1-S2-HSA CCTCC C2015171接种，在溶氧量50%、pH7.2及转速lOOrpm的培养条件下，采用流 加的方式进行培养。8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于:所述接种的接种量为5 X 105cellS/mL~8 X 105cells/mL〇9. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于:所述培养时的培养温度为37 ± 1°C。10. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于:所述培养时的培养基为SFM4CH0培养基。
【文档编号】C12N15/85GK106065398SQ201610353796
【公开日】2016年11月2日
【申请日】2016年5月25日 公开号201610353796.8, CN 106065398 A, CN 106065398A, CN 201610353796, CN-A-106065398, CN106065398 A, CN106065398A, CN201610353796, CN201610353796.8
【发明人】冯若飞, 李向茸, 马忠仁, 徐雷, 张海霞, 乔自林, 李明生
【申请人】西北民族大学