专利名称：一种从伪枝藻中提取伪枝藻素的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术和资源利用与可持续发展领域，更具体涉及一种利用伪枝藻提取伪枝藻素的方法。
背景技术：
目前，对伪枝藻的利用一般只停留在进行人工藻结皮上，对伪枝藻的其他应用开发几乎还是一片空白，更不用说从伪枝藻中提取伪枝藻素并加以利用了。
伪枝藻素(scytonemin)是一类黄褐色，脂溶性二聚体色素，分子量为544Da，结构为吲哚或酚亚基，其最大吸收峰在384nm。很多荒漠蓝藻都含有伪枝藻素，这种伪枝藻素具有抗紫外辐射的特性，从而保护伪枝藻免受紫外光的伤害，为伪枝藻的正常生长创造条件。伪枝藻素的这种具有极强的抗紫外辐射的能力，可用于化妆品工业。而目前，我国使用的色素主要是化学合成色素，长期使用合成色素，对人体皮肤造成损害，从而不利于人类健康。
目前，国内对伪枝藻素的提取涉足甚少，并且其提取方法繁琐，成本高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从伪枝藻中提取伪枝藻素的方法，该方法简便，操作方便，设备简单、安全可靠，成本低，产品质量好，适宜于工业化生产。
从伪枝藻中提取伪枝藻素的具体步骤如下1、培养液的配制每升水加入磷酸氢二钾0.02-0.05g、硫酸镁0.06-0.09g、氯化钙0.02-0.05g、柠檬酸0.004-0.008g、柠檬酸铁铵0.004-0.008g、乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)0.001-0.003g、碳酸钠0.01-0.04g，微量元素溶液A50.5-2ml；2、伪枝藻的培养(1)一级培养由试管原种接入三角瓶(150-200ml)，静止培养或通气培养，通气培养时，调节气流大小在1.5-3.5L.min-1，气流经过棉花球进行无菌处理，光强控制在65-85μE.m-2.s-1，温度控制在22-35℃。当培养5-10天后，转入到二级培养。
(2)二级培养将一级培养所得的培养物接入到培养瓶(500-1000ml)，通气培养，调节气流大小在2.5-5L.min-1，无菌处理，光强控制在75-95μE.m-2.s-1，温度控制在22-35℃。当培养5-10天后，转入到三级培养。
(3)三级培养将二级培养所得的培养物接入到培养瓶(5000-20000ml)，通气培养，调节气流大小在3-6L.min-1，无菌处理，光强控制在70-100μE.m-2.s-1，温度控制在22-35℃。当培养5-10天后，为继续培养的接种种源。
(4)继续培养采用三级培养后的藻种，按每升培养液中接入0.2-0.5g(湿重)伪枝藻的比例到开放式跑道循环培养池中，进行大量培养。采用玻璃温棚控制温度在28-30℃，利用自然光进行光照，光强控制在80-120μE.m-2.s-1，采用叶轮或潜水泵搅动培养基。在收获之前的3-6天内，每天两次采用UV-B照射，光强控制在120-160μE.m-2.s-1，每次时间在5-10分钟。
3、伪枝藻藻粉的制备将培养10-20天后的伪枝藻用泵抽到过滤装置——振动斜面筛上，经过振动斜面筛后，收得伪枝藻藻浆，然后将藻浆经过离心机离心，获得伪枝藻藻泥。经浓缩、脱水、干燥、粉碎后得到伪枝藻藻粉。
4、伪枝藻素(scytonemin)的提取将藻粉在28-32℃下，加入无水甲醇(藻粉∶甲醇＝1∶8-12，W/V)，利用搅拌器不停地搅拌抽提30min，抽提2-3次，直到抽提液颜色很浅。在大型离心机中，5000-8000g离心10-15min，收集上清液，然后向沉淀物中加入乙酸乙酯(其体积为前面所用甲醇总体积的十分之一)，28-32℃下继续抽提，离心，收集上清液，与甲醇抽提液合并。然后向合并后的抽提液中加入其一半体积的蒸馏水，于-5--10℃下放置10-15分钟，即可见伪枝藻素(scytonemin)沉淀析出。
5、伪枝藻素的收获与干燥将上述含伪枝藻素的溶液于大型离心机中5000-8000g离心10-15min，收集沉淀物。-60--110℃下冷冻干燥。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和显著的效果方法易行、操作方便、设备简单、经济快捷、产量高、产品质量好、安全可靠，适用于工业化规模生产。
具体实施例方式
提取伪枝藻素的具体实施步骤如下1、培养液的配制每升水加入硝磷酸氢二钾0.04g、硫酸镁0.075g、氯化钙0.036g、柠檬酸0.006g、柠檬酸铁铵0.006g、乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)0.001g、碳酸钠0.02g，微量元素溶液A51ml；2、伪枝藻的培养(1)一级培养由试管原种接入三角瓶(150-200ml)，静止培养或通气培养，通气培养时，调节气流大小在2.5L.min-1，气流经过棉花球进行无菌处理，光强控制在70μE.m-2.s-1，温度控制在30℃。当培养7-10天后，转入到二级培养。
(2)二级培养将一级培养所得的培养物接入到培养瓶(500-1000ml)，通气培养，调节气流大小在3L.min-1，无菌处理方法同上，光强控制在80μE.m-2.s-1，温度控制在30℃。当培养7-10天后，转入到三级培养。
(3)三级培养将二级培养所得的培养物接入到培养瓶(5000-20000ml)，通气培养，调节气流大小在5L.min-1，无菌处理方法同上，光强控制在90μE.m-2.s-1，温度控制在30℃。当培养7-10天后，为继续培养的接种种源。
(4)继续培养采用三级培养后的藻种，按每升培养液0.3-0.4g湿重的比例接入到开放式跑道循环培养池中，进行大量培养。采用玻璃温棚控制温度在30℃，利用自然光进行光照，光强控制在100-120μE.m-2.s-1，采用叶轮或潜水泵搅动培养基。在收获之前的3-6天内，每天两次采用UV-B照射，光强控制在140-160μE.m-2.s-1，每次时间在5-10分钟。
3、伪枝藻藻粉的制备将培养10-20天后的伪枝藻用泵抽到过滤装置——振动斜面筛上，经过振动斜面筛后，收得伪枝藻藻浆，然后将藻浆经过离心机离心，获得伪枝藻藻泥。经浓缩、脱水、干燥、粉碎(常规工艺)后得到伪枝藻藻粉。
4、伪枝藻素(scytonemin)的提取将藻粉在30℃下，加入无水甲醇(藻粉∶甲醇＝1∶10，W/V)，利用搅拌器不停地搅拌抽提30min，抽提2-3次，直至抽提液颜色很浅。在大型离心机中，5000-8000g离心10-15min，收集上清液，然后向沉淀物中加入乙酸乙酯(其体积为前面所用甲醇总体积的十分之一)，30℃下继续抽提，离心，收集上清液，与甲醇抽提液合并。然后向合并后的抽提液中加入其一半体积的蒸馏水，于-5℃下放置10-15分钟，即可见伪枝藻素沉淀析出。
5、伪枝藻素的收获与干燥将上述含伪枝藻素的溶液于大型离心机中5000-8000g离心10-15min，收集沉淀物。-100℃下冷冻干燥。
权利要求
1.一种从伪枝藻中提取伪枝藻素的方法，包括如下步骤A、培养液的配制每升水加入磷酸氢二钾0.02-0.05g、硫酸镁0.06-0.09g、氯化钙0.02-0.05g、柠檬酸0.004-0.008g、柠檬酸铁铵0.004-0.008g、乙二胺四乙酸二钠盐0.001-0.003g、碳酸钠0.01-0.04g，微量元素溶液A50.5-2ml；B、伪枝藻的培养首先是一级培养，由试管原种接入三角瓶中，通气培养，调节气流在1.5-3.5L.min-1，气流经过棉花球进行无菌处理，光强控制在65-85μE.m-2.s-1，温度控制在22-35℃，当培养5-10天后，转入到二级培养；其次是二级培养，将一级培养所得的培养物接入到培养瓶中，通气培养，调节气流在2.5-5L.min-1，无菌处理，光强控制在75-95μE.m-2.s-1，温度控制在22-35℃，当培养5-10天后，转入到三级培养；第三是三级培养，将二级培养所得的培养物接入到培养瓶中，通气培养，调节气流在3-6L.min-1，无菌处理，光强控制在70-100μE.m-2.s-1，温度控制在22-35℃，当培养5-10天后，为继续培养的接种种源；第四是继续培养，采用三级培养后的藻种，按每升培养液0.2-0.5g湿重的比例接入到开放式跑道循环培养池中，进行培养，采用玻璃温棚控制温度在28-30℃，利用自然光进行光照，光强控制在80-120μE.m-2.s-1，采用叶轮或潜水泵搅动培养基，在收获之前的3-6天内，每天两次采用UV-B照射，光强控制在120-160μE.m-2.s-1，每次时间在5-10分钟；C、伪枝藻藻粉的制备将培养10-20天后的伪枝藻用泵抽到过滤装置——振动斜面筛上，经过振动斜面筛后，收得伪枝藻藻浆，然后将藻浆经过离心机离心，获得伪枝藻藻泥，经浓缩、脱水、干燥、粉碎后得到伪枝藻藻粉；D、伪枝藻素的提取将藻粉在28-32℃下，加入8-12倍体积的无水甲醇，利用搅拌器不停地搅拌抽提30min，抽提2-3次，直到抽提液颜色很浅，在离心机中，5000-8000g离心10-15min，收集上清液，然后向沉淀物中加入乙酸乙酯，28-32℃下继续抽提，离心，收集上清液，与甲醇抽提液合并，然后向合并后的抽提液中加入其一半体积的蒸馏水，于-5--10℃下放置10-15分钟后，伪枝藻素沉淀便析出；E、伪枝藻素的收获与干燥将上述含伪枝藻素的溶液于离心机中5000-8000g离心10-15min，收集沉淀物，-60--110℃下冷冻干燥。
全文摘要
本发明公开了一种从伪枝藻中提取伪枝藻素的方法。首先是配制伪枝藻培养液采用磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钙、柠檬酸、柠檬酸铁铵、乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)、碳酸钠，微量元素溶液A
文档编号C09B61/00GK1563205SQ20041001292
公开日2005年1月12日 申请日期2004年3月27日 优先权日2004年3月27日
发明者刘永定, 谢作明, 沈银武, 黄泽波, 胡春香, 李敦海, 陈兰洲 申请人:中国科学院水生生物研究所