专利名称：检测钠/钾离子比的方法和试剂盒以及系统的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药领域，具体而言涉及一种钠/钾离子比检测方法和试剂盒以及系统。
背景技术：
人体内的钠、钾是维持细胞生理活动的主要阳离子，是保持机体的正常渗透压及酸碱平衡，参与糖及蛋白质代谢，保证神经肌肉的正常功能所必需，其含量是人体生理活动的重要指标。尿液、血清中钠、钾离子的含量水平在临床上可用于诊断一些肾脏、心脏等方面的疾病。人体内的钠钾离子水平处于一个平衡状态，其比率的改变对人体健康有着重要影响。对健康而言，监测钠/钾的比例可能比二者单独的绝对数值更重要。在临床上，通过检测唾液钠/钾比，可诊断醛固酮增多症。此外，美国学者近日研究证实24小时尿钠/钾比对心血管疾病风险的预测价值显著优于单纯的尿钠或尿钾检测。由此可见，钠/钾比的监测对预防心血管疾病具重要意义。现有技术中测定钠、钾离子浓度的方法主要有中子活化法、同位素稀释质谱法、化学测定法、火焰光度法、离子选择电极法、酶动力学法、原子分光光度法等。目前，临床上经常使用的方法是火焰光度法和离子选择电极法。(I)火焰光度法火焰光度法是一种发射光谱分析法，利用火焰中激发态原子回降至基态时发射的光谱强度进行含量分析，可检测血清、尿液、脑脊液及胸腹水的Na+和K+，该方法属于经典的标准参考法，优点是结果准确可靠，广为临床采用。通常采用的定量方法有外标准法和内标准法。外标准法一般操作误差较大，不常采用。内标法是标本及标准液采用加进相同浓度的内部标准元素进行测定，一般是加入锂内标，测定的是锂/钠或钾电流的比值，而不是单独钠或钾的电流，这样，可减小燃气和火焰温度波动等因素引起的误差，因而有较好的准确性。(2)离子选择电极法(ISE法):在专用仪器上进行血清和尿液的钾、钠离子测定。因其具有标本用量少，快速准确，操作简便等优点，是目前所有方法中最为简便准确的方法，几乎有取代其他方法的趋势。其原理是离子选择电极是一种电化学传感器，其结构中有一个对特定离子具有选择性响应的敏感膜电极，将离子活度转换成电位信号，在一定范围内，其电位与溶液中特定离子活度的对数呈线性关系，通过与已知离子浓度的溶液比较可求得未知溶液的离子活度，按其测定过程又分为直接测定法和间接测定法，目前大部分采用间接测定法，由于间接测定法将待测样本稀释后测定，所测离子活度更接近离子浓度。目前主要的电极种类有玻璃膜电极，感应材料为玻璃膜；固相电极，由难溶金属物质加压成型；液态膜电极，将环氧树脂或内装聚氯乙烯作为感应膜；缬氨霉素膜制成的K+电极。这些电极都具有一定寿命，使用一段时问后，电极会老化，且价格昂贵。(3)化学测定法目前Na+、K+的化学测定主要利用复环王冠化合物如穴冠醚或球冠醚，亦称为冠醚，均为离子载体进行测定，由于大环结构内有空穴，分子内部氧原子有未共用电子对可与金属离子结合，根据空穴大小，可选择性结合不同直径的金属离子，从而可达到测出离子浓度的目的。(4)酶法酶法测定钾的原理是利用钠依赖的β -半乳糖苷酶催化人工底物ONPG(邻硝基酚β -D-吡喃半乳糖苷);分解释放出有色产物邻硝基酚，在波长420nm处测吸光度变化。酶法测钾的原理是利用对丙酮酸激酶的激活作用，后者催化磷酸烯醇式丙酮酸变为乳酸同时伴有还原型辅酶I的消耗，在波长340nm处测NADH的吸光度下降。酶法的优点是不需特殊仪器，缺点是价格较贵。(5)原子分光光度法也可用于检测血清中钾、钠离子，但操作复杂，误差较大，不及火焰光度法简便。现有的这些方法都是分别测定钠、钾离子浓度，再在测出的数值基础上计算钠/钾离子比。到目前为止，尚没有直接测定钠/钾离子比的方法。
发明内容
本发明的目的提供一种利用菁染料超分子与鸟嘌呤四链体(G-四链体)作用体系检测钠/钾离子比的新方法，以 及应用该方法配制而成的钠/钾比检测试剂盒。利用该试剂盒中的试剂，可利用荧光光谱仪器定量分析液体中钠/钾离子比，测定过程不受其他元素的影响，精确度高。同时，由于该试剂灵敏度很高，对不同钠/钾离子比表现出颜色上的变化，肉眼可见，可实现可视化检测。本发明的总体技术路线为通过加入钠/钾离子来调控G-四链体结构的形成或构象转变，随之菁染料识别G-四链体结构的变化，从而反映出钠/钾比值水平。具体为在低钠/钾比的环境下，DNA序列形成反平行结构G-四链体，随钠/钾比降低反平行G-四链体则发生构象转变，随着G-四链体构象转变，菁染料的聚集形态发生变化，从而在颜色上发生改变，达到肉眼观测，同时在荧光光谱上也发生明显的变化，荧光强度的变化程度与钠/钾比值成正比，从而实现定量反映钠/钾比水平。本发明的第一方面提供一种检测液体样品中钠/钾比的方法，所述方法包括以下步骤(I)用PH6. 2 8. 2的缓冲溶液和可溶性钠盐和钾盐配制钠/钾离子比不同的多个溶液样本，其中每个所述溶液样本中含有相同浓度的在钠、钾离子存在下能够分别形成不同G-四链体结构的DNA分子以及相同浓度的菁染料；(2)将所述多个溶液样本置于荧光光谱仪下，采用540nm至570nm的激发波长，检测在采集波长处的荧光强度；(3)以各个所述溶液样本的钠/钾比作为横坐标或纵坐标，以步骤(2)中测得的在采集波长处的荧光强度值为纵坐标或横坐标作图，从而获得钠/钾比的标准曲线；(4)在待测液体样品中加入所述DNA分子和菁染料，并调节pH值，以使待测液体样品中所述DNA分子的浓度、菁染料的浓度以及pH值与步骤(I)中的溶液样本一致，从而得到测试溶液；(5)将步骤(4)中获得的测试溶液置于荧光光谱仪下，采用与步骤(2)中相同的激发波长，检测波长在所述采集波长处的荧光强度；(6)利用步骤(5)中测得的荧光强度值在步骤(3)中获得的钠/钾比标准曲线中找到对应的测试溶液的钠/钾比值；其中所述采集波长在570nm至700nm范围内。本发明的方法可以方便地用于检测各种溶液样品中的钠/钾比值，例如，可以检测人或动物血液、尿液、唾液、细胞或其他体液中的钠/钾比。根据本发明第一方面的方法，其中所述缓冲液选自三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、三乙醇胺缓冲液、咪唑-盐酸缓冲液、双甘氨肽缓冲液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液。根据本发明第一方面的方法，其中所述在钠、钾离子存在下能够分别形成不同G-四链体结构的DNA分子为分子序列中含有下式I的结构的DNA分子GGYGGZGGMGG式I其中式I中的G代表鸟嘌呤，Y、Z、M分别代表一个或多个任意碱基，G代表鸟嘌呤碱基。根据本发明第一方面的方法，其中所述菁染料为下式II的化合物
权利要求
1.一种检测液体样品中钠/钾离子比的方法，所述方法包括以下步骤 (1)用PH6.2 8. 2的缓冲溶液和可溶性钠盐和钾盐配制钠/钾离子比不同的多个溶液样本，其中每个所述溶液样本中含有相同浓度的菁染料及在钠、钾离子存在下能够分别形成不同G-四链体结构的DNA分子； (2)将所述多个溶液样本置于荧光光谱仪下，采用540nm至570nm的激发波长，检测采集波长处的荧光强度值； (3)以各个所述溶液样本的钠/钾比作为横坐标或纵坐标，以步骤(2)中测得的采集波长处的荧光强度值为纵坐标或横坐标作图，从而获得钠钾离子比的标准曲线； (4)在待测液体样品中加入所述的DNA分子，并调节pH值，以使待测液体样品中的菁染料和DNA分子的浓度以及pH值与步骤(I)中的溶液样本一致，从而得到测试溶液； (5)将步骤(4)中获得的测试溶液置于荧光光谱仪下，采用与步骤(2)中相同的激发波长，检测波长在所述采集波长处的荧光强度值； (6)利用步骤(5)中测得的中测得的荧光强度值在步骤(3)中获得的钠/钾离子比标准曲线中找到对应的测试溶液的钠/钾比值； 其中所述采集波长在570nm至700nm的范围内。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述在钠、钾离子存在下能够分别形成不同G-四链体的DNA分子为分子序列中含有下式I的结构的DNA分子GGYGGZGGMGG 式I 其中Y、Z和M独立地代表一个或多个任意碱基，G代表鸟嘌呤碱基。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述G-四链体DNA的序列选自以下序列TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG、AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG、TTGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGA、TGAGGGTGGGGAGGGTGGGGAA、AGGGAGGGCGCTGGGAGGAGGG、GGGCGCGGGAGGAATTGGGCGGG、GGTTGGTGTGGTTGG、 TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG、 GGGCGCGGGAGGAAGGGGGCGGG 或GGGCGCGGGAGGAATTGGGCGGG。
4.如权利要求1或2所述的方法，其中所述菁染料为式II的化合物，
5.如权利要求4所述的方法，其中所述C1-C6的烷基选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、正己基或异己基。
6.如权利要求4所述的方法，其中R1选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、正己基、异己基、苯基、甲基苯基或二甲基苯基；R2、R3> R4和R5独立地选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戍基、异戍基、正己基或异己基。
7.如权利要求4所述的方法，其中所述5元至7元环结构为含有或不含有N或S原子的饱和或不饱和环结构。
8.如权利要求4所述的方法，其中Y选自氟、氯、溴、碘阴离子或三乙胺阳离子。
9.如权利要求1或2所述的方法，其中所述缓冲液选自三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、三乙醇胺缓冲液、咪唑-盐酸缓冲液、双甘氨肽缓冲液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液、磷酸钠-磷酸氢钠缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、硼砂-氢氧化钠缓冲液或磷酸钠缓冲液。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述溶液样本中钠/钾离子比的范围优选在O至10的范围；所述在钠、钾离子存在下能够分别形成不同G-四链体结构的DNA分子在溶液样本中的浓度在O. 5至30 μ mo I/L的范围；所述菁染料在溶液样本中的浓度在I至30 μ mo I/L的范围。
全文摘要
本发明涉及检测钠/钾离子比的方法和试剂盒以及系统。本发明涉及检测溶液中钠/钾离子摩尔比的方法，包括(1)配制钠/钾离子比不同的多个溶液样本，其中每个所述溶液样本中含有相同浓度的菁染料及在钠、钾离子存在下能够分别形成不同G-四链体结构的DNA分子；(2)检测采集波长处的荧光强度值；(3)以各个所述溶液样本的钠/钾比作为横坐标或纵坐标，以步骤(2)中测得的采集波长处的荧光强度值为纵坐标或横坐标作图，从而获得钠钾离子比的标准曲线；(4)在待测液体样品中加入所述的DNA分子，并调节pH值，从而得到测试溶液；(5)检测波长在所述采集波长处的荧光强度值；(6)在钠/钾离子比标准曲线中找到对应的测试溶液的钠/钾比值。
文档编号C09B23/06GK103063629SQ20121055312
公开日2013年4月24日 申请日期2012年12月18日 优先权日2012年12月18日
发明者孙红霞, 唐亚林, 向俊锋, 杨千帆, 管爱娇, 刘岩 申请人:中国科学院化学研究所