本发明涉及红曲色素的分离方法，特别涉及一种利用大孔吸附树脂分离水溶性红曲色素的方法及其应用。
背景技术：
红曲色素是一种天然色素，由红曲菌发酵生产，从红曲霉发酵的红曲米中提出的色素主要是胞内色素，这些色素易溶于乙醇、丙酮等极性较大的有机溶液，都是非水溶性的色素，在食品应用方面受到一定的限制。随着红曲色素研究的深入，近年来以液体发酵生产的红曲色素则具有良好的水溶性。水溶性红曲色素的热稳定性、耐光照、耐氧化剂和耐还原剂的性能好，其开发研究具有广阔的前景和重大的经济效益。但目前对红曲发酵液中水溶性色素的分离纯化的研究报道相对较少，效率较低。如有报道用离子交换树脂(D380,D301R,110H等)分离红曲色素，存在难于洗脱或洗脱率不高等问题(连喜军等，食品工业科技，2003,24(8):81-83)；有报道用阴离子交换树脂D301分离水溶性红曲色素，获得纯度很高的红曲红色素，存在不能全部回收色素的问题(熊何健等，西南大学学报自然科学版，2009,31(9):20-24)；有报道用大孔吸附树脂(X-5、AB-8、D14、D16等)分离红曲色素，存在回收率偏低等问题(童群义，四川轻化工学院学报，1999,12(4):9-12)；有报道用大孔树脂NKA等处理红曲色素废液，存在吸附率和洗脱率都偏低的问题(容艳筠等，中国食品添加剂，2012,01:154-157)。
通常在培养基中增加可溶性蛋白质、肽、氨基酸促进水溶性红曲色素的生成，Hassan Hajjaj等(International Journal of Food Science and Technology,2015,50:1731-1736)通过优化红曲发酵培养基中的碳氮源比例以及发酵条件增加胞外红曲红色素，但使得发酵液成分变得更加复杂，红、橙、黄三类色素与蛋白质、多肽、氨基酸、氨基葡萄糖等物质结合生成多种衍生物。另外，Chen gong等(BMC Biotechnology,2015,15(1):72-80)通过单一补加碳源(葡萄糖)进行高密度发酵使得红曲霉液体发酵胞外黄色素大量增加，但最终得到的红曲发酵液中残糖高于25g/L，加大了后期水溶性红曲色素产品分离和纯化的难度，因此，亟需一种高效分离水溶性红曲色素的方法。
技术实现要素：
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种利用大孔吸附树脂分离水溶性红曲色素的方法。
本发明的另一目的在于提供所述利用大孔吸附树脂分离水溶性红曲色素方法的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种利用大孔吸附树脂分离水溶性红曲色素的方法，包括如下步骤：
(1)发酵液的预处理：将液态发酵好的红曲霉菌发酵原液进行固液分离，取液体，得到胞外水溶性红曲色素发酵液；
(2)树脂的预处理：将大孔吸附树脂进行预处理，得到湿树脂；
(3)吸附：将步骤(2)中得到的湿树脂加入到步骤(1)中得到的胞外水溶性红曲色素发酵液中进行吸附，固液分离，取固体，得到滤饼；
(4)解吸：将步骤(3)中得到的滤饼用乙醇进行洗脱，固液分离，收集液体，得到洗脱液；
(5)去除洗脱剂：将步骤(4)中得到的洗脱液除去洗脱剂，得到浓缩液；
(6)真空干燥：将步骤(5)中得到的浓缩液进行冷冻真空干燥，得到水溶性红曲色素。
步骤(1)中所述的液态发酵的培养基优选为：每100mL液态发酵培养基中，含葡萄糖10～30g、(NH4)2SO4 0.5g、KH2PO4 0.5g、MgSO4·7H2O 0.05g、FeSO4·7H2O 1.0mg、ZnSO4·7H2O 1.0mg、MnSO4·H2O 3.0mg，用水定容至100ml，pH自然。
所述的水为蒸馏水或去离子水。
步骤(1)中所述的红曲霉菌优选为保藏编号为CGMCC No.10910的红曲霉菌(Monascus ruber)。
步骤(1)中所述的胞外水溶性红曲色素发酵液的色价为40～250AU350/mL，优选为99.13～135.88AU350/mL。
步骤(1)、(3)和(4)中所述的固液分离的方法优选为抽滤。
步骤(2)中所述的大孔吸附树脂优选为大孔吸附树脂DA201，更优选为大孔吸附树脂DA201-B或DA201-C。
步骤(2)中所述的将大孔吸附树脂进行预处理的方法优选通过如下步骤实现：
(a)将大孔吸附树脂用乙醇浸泡，再用乙醇冲洗，洗至流出的乙醇无浑浊，然后用水洗至无醇味；
(b)接着用HCl溶液浸泡，用水洗至中性，再用NaOH溶液浸泡，用水洗至中性，得到处理后的大孔吸附树脂(湿树脂)；
(c)到此终止；或重复步骤(b)2～3次。
步骤(a)中所述的乙醇的浓度优选为体积百分比95％。
步骤(a)中所述的用乙醇浸泡的时间为8～24h，优选为12h。
步骤(a)和步骤(b)中所述的水优选为蒸馏水或去离子水。
步骤(b)中所述的HCl溶液的浓度优选为体积百分比2～8％，优选为4％。
步骤(b)中所述的用HCl溶液浸泡的时间优选为2～8h，优选为4h。
步骤(b)中所述的NaOH溶液的浓度优选为体积百分比2～8％，优选为4％。
步骤(b)中所述的用NaOH溶液浸泡的时间优选为2～8h，优选为4h。
步骤(b)中所述的得到的处理后的大孔吸附树脂以湿法保存。
步骤(3)中所述大孔吸附树脂添加量为按每mL胞外水溶性红曲色素发酵液配比0.2～0.5g大孔吸附树脂计算，优选为按每mL胞外水溶性红曲色素发酵液配比0.43～0.5g大孔吸附树脂计算。
步骤(3)中所述的吸附包括通过静置方式进行静态吸附和通过振荡的方式进行吸附。
所述的吸附的时间为0.15～2.5h，优选为0.25～0.5h。
步骤(4)中所述的洗脱为静态洗脱或动态梯度洗脱。
所述的静态洗脱的方法优选通过如下步骤实现：将得到的滤饼装入容器中，加入乙醇，静置进行洗脱。
所述的容器优选为玻璃容器，更优选为烧杯。
所述的乙醇的浓度优选为体积百分比95％。
所述的动态梯度洗脱的方法优选通过如下步骤实现：将得到的滤饼装入常压层析柱，用2倍柱体积的不同浓度的乙醇进行梯度洗脱。
所述的乙醇的浓度为体积百分比25％、50％、75％和100％。
所述的梯度洗脱的速度优选为1～10BV/h；优选为5BV/h。
所述的洗脱的时间为0.15～2.5h，优选为0.25～0.5h。
步骤(5)中所述的去除洗脱剂的方法优选通过减压蒸发方式去除，同时可回收洗脱剂，资源得以重复利用。
所述的减压蒸发在45℃水浴、真空度≤-0.085Mpa条件下进行。
所述的利用大孔吸附树脂分离水溶性红曲色素的方法在分离水溶性红曲色素中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、本发明利用大孔吸附树脂分离水溶性红曲色素的方法，在动态吸附洗脱下可得到高回收率(95％以上)以及脱盐(95％以上)、脱糖(98％以上)的胞外水溶性红曲色素，实现了天然水溶性红曲色素的分离纯化，同时本发明使用的大孔树脂DA201对水溶性红曲色素的吸附解吸过程迅速0.25h～0.5h基本上可达到吸附解吸平衡，这对工业生产具有广阔应用前景。
2、本发明是根据水溶性红曲色素之间以及红曲发酵液中无机盐、多糖、蛋白质等杂质中各成分分子大小的不同，利用大孔吸附树脂将红曲色素进行提纯分离，解决水溶性色素不稳定以及发酵液中杂质多的问题；同时通过除去红曲色素发酵液多糖、无机盐等杂质，实现胞外红曲色素高效分离，具有很好的应用前景及市场价值。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1利用大孔吸附树脂DA201-C分离水溶性红曲色素
(1)发酵液的预处理：将液态发酵培养基中发酵好的红曲霉菌Monascusruber(CGMCC No.10910)发酵液进行抽滤，取滤液，得到胞外水溶性红曲色素发酵液，测定胞外水溶性红曲色素的色价为99.13AU350/mL(用紫外分光光度计测定特征波长350nm处的吸光度)、盐度2.15ms/cm(电导率)、残糖含量30g/L(DNS法)，其中，液态发酵培养基的组成如下：葡萄糖7.5g，(NH4)2SO4 0.25g，KH2PO4 0.25g，MgSO4·7H2O 0.025g，KCl 0.025g，FeSO4·7H2O 0.5mg，ZnSO4·7H2O 0.5mg，MnSO4·H2O 1.5mg，用蒸馏水定容至50mL，pH自然。
(2)树脂的预处理：将购买的DA201-C大孔树脂(郑州勤实科技有限公司)用95％(v/v)乙醇溶液浸泡12h，首先用95％(v/v)乙醇冲洗，洗到流出的乙醇无浑浊，再用蒸馏水洗至无醇味；然后用4％(v/v)HCl溶液浸泡4h，用蒸馏水洗至中性，再用4％(v/v)NaOH溶液浸泡4h，用蒸馏水洗至中性，重复2次，湿法保存备用。
(3)吸附：取5mL步骤(1)得到的胞外水溶性红曲色素加入步骤(2)中经过处理的DA201-C湿树脂2.5g，搅拌均匀，静置吸附0.25h，抽滤，得到滤饼，同时测定滤液的色价为3.37AU350/mL。
(4)解吸：将步骤(3)得到的滤饼置于烧杯中，加入95％(v/v)乙醇溶液静态洗脱0.25h，抽滤，收集洗脱液，测定其盐度为0.25ms/cm(电导率)、残糖量3.37g/L(DNS法)以及色价为76.24AU350/mL(用紫外分光光度计测定特征波长350nm处的吸光度)。
(5)回收洗脱剂：将步骤(4)得到的洗脱液采用减压蒸发方式(水浴温度45℃，真空度≤-0.085MPa)回收洗脱剂，得到除去洗脱剂的浓缩液。
(6)真空干燥：将步骤(5)得到的浓缩液进行冷冻真空干燥(冷冻温度-20℃，真空≤-0.037Mpa)，得到水溶性红曲色素产品。
结果：DA201-C大孔树脂对发酵液中水溶性红曲色素的吸附率达96.60％，色素回收率为76.91％，盐去除率为88.37％，糖去除率为88.77％。表明利用大孔吸附树脂DA201-C可以得到脱盐、脱糖的高纯度水溶性红曲色素。
实施例2利用大孔吸附树脂DA201-B分离水溶性红曲色素
(1)发酵液的预处理：同实施例1中步骤(1)。
(2)树脂的预处理：本上与实施例1步骤(2)相同，区别仅在于本实施例采用DA201-B(郑州勤实科技有限公司)大孔树脂取代了实施例1中DA201-C大孔树脂。
(3)吸附：取5mL步骤(1)得到的胞外水溶性红曲色素加入步骤(2)中经过处理的DA201-B湿树脂2.5g，搅拌均匀，静置吸附30min，抽滤，得到滤饼，同时测定滤液的色价为0.88AU350/mL。
(4)解吸：将步骤(3)得到的滤饼置于烧杯中，加入95％(v/v)乙醇溶液静态洗脱0.5h，抽滤，收集洗脱液，测定其盐度为0.35ms/cm(电导率)、残糖量4.30g/L(DNS法)以及色价为75.21AU350/mL(用紫外分光光度计测定特征波长350nm处的吸光度)。
(5)回收洗脱剂：同实施例1步骤(5)。
(6)真空干燥：同实施例1步骤(6)。
结果：DA201-B大孔树脂对发酵液中水溶性红曲色素的吸附率在0.5h后可达到99.11％，色素回收率为75.87％，盐去除率为83.72％，糖去除率为85.67％。表明利用大孔吸附树脂DA201-B可以得到脱盐脱糖的水溶性红曲色素。
实施例3利用大孔吸附树脂DA201-C分离水溶性红曲色素
(1)发酵液的预处理：将液态发酵培养基中发酵好的红曲霉菌Monascusruber(CGMCC No.10910)发酵液进行抽滤，取上清液，得到胞外水溶性红曲色素发酵液，测定胞外水溶性红曲色素的色价为135.88AU350/mL(用紫外分光光度计测定特征波长350nm处的吸光度)、盐度2.37ms/cm(电导率)、残糖含量137.01g/L(DNS法)，其中，液态发酵培养基的组成如下：葡萄糖15g，(NH4)2SO4 0.25g，KH2PO4 0.25g，MgSO4·7H2O 0.025g，KCl 0.025g，FeSO4·7H2O0.5mg，ZnSO4·7H2O 0.5mg，MnSO4·H2O 1.5mg，用蒸馏水定容至50mL，pH自然。
(2)树脂的预处理：同实施例1步骤(2)。
(3)吸附：取25g步骤(2)中经过处理的DA201-C湿树脂，加入58mL步骤(1)得到的胞外水溶性红曲色素，以180rpm转速振荡吸附0.25h，抽滤，水洗至流出的水澄清，得到滤饼，同时测定滤液的色价(1.43AU350/mL)。
(4)解吸：将步骤(3)得到的滤饼装入常压层析玻璃柱(Φ15mm×305mm)，分别用2倍柱体积的不同浓度乙醇(25％、50％、75％、100％，v/v)，共8倍柱体积洗脱剂(即依次用25％、50％、75％、100％的乙醇洗脱)进行梯度洗脱，梯度洗脱速度为5BV/h。收集洗脱液，测定其盐度为0.1ms/cm(电导率)、残糖量(DNS法)2.36g/L以及色价129.55AU350/mL(用紫外分光光度计测定特征波长350nm处的吸光度)。
(5)回收洗脱剂：同实施例1步骤(5)。
(6)真空干燥：同实施例1步骤(6)。
结果：DA201-C大孔树脂对发酵液中水溶性红曲色素的吸附率达98.95％，色素回收率为95.34％，盐去除率为95.78％，糖去除率为98.28％，表明利用大孔吸附树脂DA201-C可以得到脱盐、脱糖的高纯度水溶性红曲色素产品。
对比例1利用大孔吸附树脂D150分离水溶性红曲色素
(1)发酵液的预处理：同实施例1中步骤(1)。
(2)树脂的预处理：本上与实施例1步骤(2)相同，区别仅在于本实施例采用D150(郑州勤实科技有限公司)大孔树脂取代了实施例1中DA201-C大孔树脂。
(3)吸附：取5mL步骤(1)得到的胞外水溶性红曲色素加入步骤(2)中经过处理的D150湿树脂2.5g，搅拌均匀，静置吸附30min，抽滤，得到滤饼，同时测定滤液的色价为38.30AU350/mL。
(4)解吸：将步骤(3)得到的滤饼置于烧杯中，加入95％(v/v)乙醇溶液静态洗脱0.5h，抽滤，收集洗脱液，测定其盐度为0.42ms/cm(电导率)、残糖量9.31g/L(DNS法)以及色价为11.01AU350/mL(用紫外分光光度计测定特征波长350nm处的吸光度)。
(5)回收洗脱剂：同实施例1步骤(5)。
(6)真空干燥：同实施例1步骤(6)。
结果：D150大孔树脂对发酵液中水溶性红曲色素的吸附率在0.5h后可达到61.36％，色素回收率为11.11％，盐去除率为80.47％，糖去除率为68.97％。表明利用大孔吸附树脂D150分离水溶性红曲色素，虽然可以达到一定的脱盐效果，不过得到的水溶性红曲色素回收率极低。
对比例2利用大孔吸附树脂LX-38分离水溶性红曲色素
(1)发酵液的预处理：同实施例1中步骤(1)。
(2)树脂的预处理：本上与实施例1步骤(2)相同，区别仅在于本实施例采用LX-38(郑州勤实科技有限公司)大孔树脂取代了实施例1中DA201-C大孔树脂。
(3)吸附：取5mL步骤(1)得到的胞外水溶性红曲色素加入步骤(2)中经过处理的LX-38湿树脂2.5g，搅拌均匀，静置吸附30min，抽滤，得到滤饼，同时测定滤液的色价为8.61AU350/mL。
(4)解吸：将步骤(3)得到的滤饼置于烧杯中，加入95％(v/v)乙醇溶液静态洗脱0.5h，抽滤，收集洗脱液，测定其盐度为0.72ms/cm(电导率)、残糖量6.64g/L(DNS法)以及色价为59.79AU350/mL(用紫外分光光度计测定特征波长350nm处的吸光度)。
(5)回收洗脱剂：同实施例1步骤(5)。
(6)真空干燥：同实施例1步骤(6)。
结果：LX-38大孔树脂对发酵液中水溶性红曲色素的吸附率在0.5h后可达到91.31％，色素回收率为60.31％，盐去除率为66.51％，糖去除率为77.87％。表明利用大孔吸附树脂LX-38对水溶性红曲色素的分离，可以得到一定脱糖的水溶性红曲色素，但是回收率和脱盐率都不高。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。