本发明涉及核磁共振探针技术领域，更具体地，涉及一种19f核磁共振探针及其制备方法和应用。
背景技术：
当今社会肿瘤的发病率越来越高，肿瘤的预防与早期诊断成为研究热点。尤其是恶性肿瘤，它的致死率是最高的，如果能够早期诊断与预防，就可以将恶性肿瘤扼杀于萌芽之中。研究发现，组织蛋白酶b在多种恶性肿瘤的早期呈现高表达，例如肺癌、胃癌和前列腺癌等。如果能够及时检测到组织蛋白酶b在体内的这种异常的高表达，就可以在第一时间发现癌症。
目前组织蛋白酶b的检测方法主要有荧光法、发色底物法、间接法以及核酸适配体法等，但是这些方法都属于离体检测技术。关于在体检测的技术方法鲜有相关的报道。
但是只有在体检测体内组织蛋白酶b的活性表达情况才能反映出与之相关的可能发生的肿瘤，离体检测技术并不能够反映出肿瘤的相关情况。所以，一种简单有效地能够用于在体检测组织蛋白酶b的探针是被迫切需要的。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种19f核磁共振探针，该19f核磁共振探针能够实现组织蛋白酶b在体检测。
本发明的另一个目的是提供一种19f核磁共振探针的制备方法。
本发明的再一个目的是提供19f核磁共振探针的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
一种19f核磁共振探针，其特征在于，其化学式为c49h58f6n10o7s3，其结构式如下：
本发明设计合成所述含氟的19f核磁共振探针，利用19f核磁共振探针的磁共振信号与体内组织蛋白酶b的活性成正比的特性，实现体内组织蛋白酶b的实时检测。
本发明还提供所述19f核磁共振探针(probe-1)的制备方法，包括以下步骤：
s1.利用多肽固相合成法制备化合物a，合成时氨基酸的加入顺序依次为赖氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、甘氨酸、半胱氨酸；
s2.将化合物a溶解于四氢呋喃，加入异丁基氯甲酸酯(ibcf)，在惰性气体的保护下，加入2-氰基-6-氨基苯并噻唑(cbt)，搅拌，反应，得到化合物b；
s3.将化合物b溶解在含有三氟乙酸(tfa)的二氯甲烷溶液中，反应，得到化合物c；
s4.将化合物c溶解在无水n,n-二甲基甲酰胺(dmf)溶液中，加入3,5-双三氟甲基苯甲酸(fmba)，搅拌，反应，得到化合物d；
s5.将化合物d溶解在n,n-二甲基甲酰胺(dmf)溶液中，加入氮杂环己烷，搅拌，反应产物经纯化后，即所述19f核磁共振探针。
所述化合物a参考现有的多肽固相合成法进行合成。优选地，步骤s1中，所述化合物a的制备步骤为：将树脂加入固相反应管内，溶剂采用无水n,n-二甲基甲酰胺(dmf)，依次加入相应的氨基酸进行反应，旋转蒸干，用无水乙醚将沉淀析出，离心分离，自然风干后所得到固体即为化合物a。在此过程中，赖氨酸(lys)上的氨基使用叔丁氧羰基保护基团boc封端，始终未参与反应的半胱氨酸(cys)上的氨基用芴甲氧羰基保护基团fmoc封端，二硫键使用叔丁基保护基团tbu封端，主链多肽序列为gly-phe-leu-gly。
优选地，步骤s2中，所述2-氰基-6-氨基苯并噻唑(cbt)的制备方法包括以下步骤：
以乙醇和水的混合溶液作为反应溶剂，还原铁粉和活性炭作为催化剂，将冰醋酸与2-氯-6-硝基苯并噻唑进行反应制备2-氯-6-氨基苯并噻唑，之后以无水n,n-二甲基甲酰胺作为反应溶剂，将氰化钾与2-氯-6-氨基苯并噻唑进行反应得到2-氰基-6-氨基苯并噻唑。
在本反应中使用到氰化钾，注意使用过程中的防护措施以及使用后的安全处理措施。
本发明所述制备方法所涉及原料的用量均可按照各自反应所需比例添加。具体地，步骤s1中，所述赖氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、甘氨酸、半胱氨酸的物质的量之比为1:1:1:1:1:1。步骤s2中，所述化合物a、异丁基氯甲酸酯、2-氰基-6-氨基苯并噻唑的物质的量之比为1:1:1。步骤s3中，所述含有三氟乙酸的二氯甲烷溶液中三氟乙酸的质量分数为95％。步骤s4中，所述化合物c与3,5-双三氟甲基苯甲酸的物质的量之比为1:1。
纯化步骤能够提供所述探针的纯度。优选地，步骤s5中，所述纯化为hplc纯化。
所述hplc纯化的条件如下：采用制备色谱柱(19×250mm，5μmbeh填料，美国waters公司)，洗脱剂为纯水和甲醇(体积比例由4:6到0:10，分别为4:6，3:7，2:8，1:9，0:10)，流速1.0ml/min。纯化步骤如下：先用低浓度的洗脱剂(4:6)对整个色谱体系进行平衡，直到基线为一条直线。然后将样品经添加进色谱柱。等待梯度结束后，用高浓度的洗脱剂(0:10)冲洗色谱柱直至残余物全部冲下。再用低浓度的洗脱剂(4:6)对整个色谱体系进行平衡，以完成一个完整的hplc纯化过程。
本发明所述19f核磁共振探针能够用于检测组织蛋白酶b，因此本发明的另一个目的在于提供所述19f核磁共振探针在检测组织蛋白酶b中的应用。
根据上述应用，本发明还进一步提供所述19f核磁共振探针在制备用于检测癌症的试剂的应用。
根据上述应用，所述19f核磁共振探针在制备用于检测癌症的试剂的应用。
目前，组织蛋白酶b检测的技术手段大部分为离体检测，在体检测方法极少有报道，并且组织蛋白酶b在多种恶性肿瘤的早期呈现高表达，例如肺癌、胃癌和前列腺癌等。所述19f核磁共振探针可制备成用于检测癌症的试剂，在体检测组织蛋白酶b的活性表达，从而可以及时地发现早期的恶性肿瘤，为肿瘤的治疗赢得时间。
具体地，所述19f核磁共振探针在进入有机体后经历的代谢过程为：
如图10和11所示，目标探针进入体内后，在细胞内谷胱甘肽(gsh)的作用下自组装成纳米聚集体粒子，此时磁共振信号消失或大大减弱，由于组织蛋白酶b对其具有剪切作用，随着组织蛋白酶b的剪切作用，经历解组装过程，在此过程中磁共振信号逐渐增强，组织蛋白酶b与磁共振信号强度成正比。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明设计了一种新型含氟的19f核磁共振探针，所述19f核磁共振探针能够应用于检测组织蛋白酶b，利用19f核磁共振探针的磁共振信号与体内组织蛋白酶b的活性成正比的特性，信号越强则组织蛋白酶b的活性越高，超过一定阈值时即与恶性肿瘤相关，为肿瘤的早期检测也提供了新的技术手段。
附图说明
图1为19f核磁共振探针的合成流程示意图。
图2为本发明所述化合物a的结构式图。
图3为本发明所述化合物b的结构式图。
图4为本发明所述化合物c的结构式图。
图5为本发明所述化合物d的结构式图。
图6为本发明所述19f核磁共振探针的结构式图。
图7为本发明所述19f核磁共振探针的1hnmr谱图。
图8为本发明所述19f核磁共振探针的13cnmr谱图。
图9为本发明所述19f核磁共振探针的质谱图。
图10为本发明所述19f核磁共振探针在进入有机体后经历的代谢过程示意图之一。
图11为本发明所述19f核磁共振探针在进入有机体后经历的代谢过程示意图之二。
图12为本发明所述19f核磁共振探针注入小鼠体内后磁共振波谱随时间变化图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明，应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明，可以在本发明权利限定的范围内进行各种改变。实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法，所使用的原料，试剂等，如无特殊说明，均为可从常规市购等商业途径得到的原料和试剂。
实施例1
19f核磁共振探针的制备
19f核磁共振探针的制备方法，如图1～6所示，包括以下步骤：
1)2-氰基-6-氨基苯并噻唑(cbt)的合成
在wt98％浓硫酸条件下，将10mmol2-氯苯并噻唑与10mmol硝酸钾反应生成10mmol2-氯-6-硝基苯并噻唑。在冰醋酸、水、乙醇、还原铁粉、活性炭的条件下，其中乙醇和水的混合溶液是反应溶剂，用量为乙醇20ml，纯水20ml，还原铁粉和活性炭是反应的催化剂，用量为铁粉0.01g，活性炭0.01g，20mmol冰醋酸与10mmol2-氯-6-硝基苯并噻唑发生反应合成得到10mmol2-氯-6-氨基苯并噻唑。无水n,n-二甲基甲酰胺(dmf)作为反应溶剂，用量为15ml，在使用前可以采用分子筛除水或者蒸馏方式除水，10mmol氰化钾与10mmol2-氯-6-氨基苯并噻唑发生反应最终生成10mmol2-氰基-6-氨基苯并噻唑，即cbt。
2)化合物a的合成：
采用固相多肽合成方法(solidphasepeptidesynthesis,spps)，赖氨酸(lys)上的氨基使用叔丁氧羰基保护基团boc封端，始终未参与反应的半胱氨酸(cys)上的氨基用芴甲氧羰基保护基团fmoc封端，二硫键使用叔丁基保护基团tbu封端，主链多肽序列为gly-phe-leu-gly。将2.0g树脂加入固相反应管内，溶剂采用无水n,n-二甲基甲酰胺(dmf)溶液30ml，依次加入相应的氨基酸赖氨酸10mmol、甘氨酸10mmol、苯丙氨酸10mmol、亮氨酸10mmol、甘氨酸10mmol、半胱氨酸10mmol进行反应，采用旋转蒸发仪蒸干后，用无水乙醚100ml将沉淀析出，采用冷冻离心机分离得到纯净的沉淀，自然风干后得到的固体多肽即为化合物a。
3)化合物b的合成：
在圆底烧瓶中将10mmol化合物a溶解于30ml四氢呋喃，加入10mmol异丁基氯甲酸酯(ibcf)，在氮气气氛保护下，加入10mmol2-氰基-6-氨基苯并噻唑(cbt)，在室温搅拌条件下使其发生化学反应，反应得到的产物用hplc纯化，最终得到的反应产物即为化合物b。
3)化合物c的合成：
将10mmol化合物b溶解在wt95％三氟乙酸(tfa)的二氯甲烷溶液30ml中，室温搅拌条件下反应4个小时，脱去boc保护基团，得到的产物用hplc纯化，最终得到的反应产物即为化合物c。
4)化合物d的合成：
将10mmol化合物c溶解在无水n,n-二甲基甲酰胺(dmf)溶液20ml中，加入10mmol3,5-双三氟甲基苯甲酸(fmba)，室温搅拌条件下反应，反应得到的产物用hplc纯化，最终得到的产物即为化合物d。
5)19f核磁共振探针的合成：
将10mmol化合物d溶解在n,n-二甲基甲酰胺(dmf)溶液20ml中，加入10mmol氮杂环己烷，室温搅拌条件下进行反应，脱去fmoc保护基团，反应得到的产物经hplc纯化，hplc纯化的条件如下：采用制备色谱柱(19×250mm，5μmbeh填料，美国waters公司)，洗脱剂为纯水和甲醇(体积比例由4:6到0:10，分别为4:6，3:7，2:8，1:9，0:10)，流速1.0ml/min。纯化步骤如下：先用低浓度的洗脱剂(4:6)对整个色谱体系进行平衡，直到基线为一条直线。然后用进样针吸取一定量的样品，将样品经由进样阀注射进色谱柱，分离得到19f核磁共振探针。等待梯度结束后，用高浓度的洗脱剂(0:10)冲洗色谱柱直至残余物全部冲下。再用低浓度的洗脱剂(4:6)对整个色谱体系进行平衡，以完成一个完整的hplc纯化过程。
19f核磁共振探针的表征
利用核磁共振对上述制备得到的反应产物进行表征，如图7和8所示。
如图9所示，经质谱检测得到反应产物的分子质量为1108。
试验
本试验以接种了肺癌肿瘤的小鼠作为试验对象，将合成的19f核磁共振探针注射入小鼠体内，选取不同的时刻进行磁共振波谱分析，以验证19f核磁共振探针的作用。
首先，在磁共振波谱分析前，需要标定磁共振信号与含氟探针浓度的关系曲线。配制不同浓度的含氟探针生理盐水溶液x，探针浓度分别为1、5、10、15、20、25、30mmol/l，利用磁共振波谱仪检测其对应的磁共振信号强度y，绘制y-x的曲线，得到磁共振信号强度与含氟探针浓度的标准曲线。
之后将含氟探针溶解于生理盐水中，配制成wt5％生理盐水溶液通过尾静脉注射入小鼠体内，选取不同的时刻(t＝0、1、3h)进行磁共振波谱分析，磁共振实验结果如图12所示。
实验结果分析：t＝0时，含氟探针刚刚进入有机体还没有发生代谢，所以信号最强；t＝1h时，含氟探针在细胞内谷胱甘肽(gsh)的作用下自组装成纳米聚集体粒子，所以信号最弱；t＝3h时，因为小鼠接种了肺癌肿瘤，它体内的组织蛋白酶b异常表达，纳米聚集体粒子在组织蛋白酶b的酶剪切作用下解组装成含19f的小分子，所以信号很强。探针注入体内后，磁共振波谱信号先减弱后增强，在增强的过程中伴随着酶切作用，反映了组织蛋白酶b的活性高低。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。