本发明属于高分子材料、分析化学、纳米科学、生物分析化学领域，具体涉及一种用于大分子蛋白质偶联的高稳定性胶束型水溶量子点。
背景技术：
近年来，对大分子蛋白质进行高效的标记和显影，一直是临床疾病诊断和生物医学基础研究所关注的热点。在目前已有的荧光标记材料中，量子点这种无机纳米材料的荧光性能最为优异。量子点不仅荧光强度高，发射峰的半峰宽窄且高度对称，具有更大的stoke位移，抗光漂白能力更强，而且量子点的荧光发射波长可通过材料的组成和粒径选择实现有效控制，从而在同一激发光作用下同时得到多种发射波长的荧光。因此量子点在生物成像和疾病诊断领域具有更大的应用潜力。但是高质量的量子点一般都是通过有机相高温裂解法合成，通常呈现极强的疏水性，无法直接用于大分子蛋白质的标记。因此如何实现油溶性量子点和大分子蛋白质之间稳定而高效的偶联，是量子点最终应用于生物成像和疾病诊断的关键。
为实现上述目标，通常的思路是先将油溶性量子点改性成表面含有功能性基团的水溶性量子点，然后通过基团反应得到量子点--大分子蛋白质的偶联体。而如何实现油溶性量子点的水溶性改性，目前已经得到了广泛的研究，可大致分为如下三类：
1.配体交换：即利用一端含有端巯基或者端氨基的亲水性配体置换油性量子点表面的疏水性配体。该方法优点是简单易行，通过配位键将亲水性配体分子固定在量子点的表面，使油溶性量子点获得水溶性。该方法的优点是操作简单，所得水溶性量子点的粒径小，比表面积大，有助于提高后续偶联反应的效率。但是由于配位结合的结合力较弱，同时容易受到环境ph值和离子强度的影响缺点是稳定性不佳，因此该方法制备的水溶性量子点稳定性不佳(y.zhang，a.clapp.sensors2011，11，11036-11055)。
2.表面硅烷化：即在油溶性量子点表面形成一层或者多层无定型二氧化硅，从而赋予量子点水溶性。由于二氧化硅在水相环境中的稳定性不受ph值和离子强度影响，因此通过这种方式改性的水溶性量子点，不仅可在水相环境中长期保存，且与蛋白质偶联时可表现出更高的反应活性。但是量子点的表面硅烷化过程较为复杂，其本质是一个多步化学反应，反应过程中加入的表面活性剂、碱性催化剂、反应前驱体及其水解产物等，均会不同程度地降低量子点的量子产率，导致其荧光强度损失(masihdarbandi，ralfthomann，andthomasnann，chem.mater.2005，17，5720-5725)。这些因素都会降低量子点-大分子蛋白质偶联体的诊断灵敏度和显影的分辨率，不利于其实际的生物学应用。
3.两亲性聚合物的包被：即利用两亲性聚合物包裹油溶性量子点形成核壳结构的胶束，从而赋予量子点水溶性。该方法制备过程简单，且两亲性聚合物的疏水链段不会直接作用于疏水量子点的表明，因此产物的量子产率能得到很好的保持。目前已有多种结构的两亲性聚合物(梳状或者接枝两亲性大分子、线性的两嵌段两亲性聚合物等)用于量子点的水溶性改性(w.w.yu，e.chang，j.c.falkner，etal.j.am.chem.soc.2007，129，2871-2879；w.wang，d.cheng，f.gong，etal.adv.mater，2012，24，115-120)，所得到的胶束型水溶量子点，其自身的稳定性也可以不受环境ph值和离子强度的影响，具有较高的稳定性和参与后续偶联反应的活性。但是通过这种方法得到的水溶性量子点在与生物大分子偶联标记时往往稳定性不佳。特别是当分子量超大的生物大分子蛋白质(分子量≥100kd)通过一定的反应偶联到两亲性聚合物的亲水末端，由于两亲性聚合物与量子点之间的疏水相互作用力属于较弱的作用力，不足以将超大分子量的蛋白质稳定地束缚在水溶性量子点的表面。因此限制了这种方法制备的水溶性量子点在标记大分子蛋白质方面的应用。
基于现有研究可以发现，目前主流的油溶性量子点的水溶性改性方法都存在各自的缺点，但是在这三种方法中，利用两亲性聚合物包被制备的胶束型水溶性量子点最具发展潜力，因为它既能保持改性后量子点的量子产率，又能在复杂的水相环境中具有较高的稳定性，同时还具有较高的蛋白质偶联活性。因此在两亲性聚合物包被法改性量子点的基础上，如何在结构上进一步对胶束型水溶性量子点进行优化，使其在与蛋白质形成偶联体后具有更高的稳定性，最终可广泛适用于大分子蛋白质的偶联和标记，是制约量子点应用于临床疾病诊断和生物医学基础研究的瓶颈。
技术实现要素：
为解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种用于大分子蛋白质偶联的高稳定性胶束型水溶量子点。通过优化三嵌段两亲性聚合物的结构和适当的胶束制备及交联后处理方法，该发明所涉及的这种胶束型的水溶性量子点不仅实现了对油溶性量子点的亲水化改性，同时该胶束型的水溶性量子点被交联层稳定，并且最外层被羧基、巯基或者氨基等可与蛋白质发生偶联反应的功能性基团完全覆盖。因此该胶束型的水溶性量子点为后续生物大分子蛋白质的偶联提供了很好的荧光标记材料。
为了实现上述目标，本发明提供的技术方案为：
制备一种用于大分子蛋白质偶联的高稳定性胶束型水溶量子点，所述的胶束型水溶量子点是由三嵌段两亲性聚合物和油溶性量子点通过疏水相互作用形成的一种三层核壳结构：其最内层为疏水内核层，由油溶性量子点和三嵌段两亲性聚合物的疏水性嵌段形成，用以包裹油溶性量子点；紧邻疏水内核的中间层为网状交联层，由三嵌段两亲性聚合物的交联嵌段通过交联反应形成，用以高度强化胶束的稳定性；最外层为三嵌段两亲性聚合物的亲水嵌段构成的亲水层，用以使整个胶束可以稳定分散在水相体系中，同时亲水嵌段的末端被功能性基团封端用于与大分子蛋白质偶联。最终得到的胶束型水溶量子点的水合粒径为20～150nm，其粒径分布可以通过胶束制备过程中聚合物/量子点的摩尔比和有机溶剂的选择进行有效的控制。被包裹在胶束内核中的量子点不仅保持了原有的光学性能和量子产率，而且胶束的交联层和亲水层共同赋予了胶束型水溶量子点极高的胶体稳定性。由于构成最外层的亲水层的亲水嵌段被功能性端基封端，因此所述的胶束型水溶量子点可以通过表面功能性基团与大分子蛋白质偶联，最终实现量子点对生物大分子的高效偶联和稳定标记。
本发明中，所述的被三嵌段两亲性聚合物包裹的油溶性量子点，其粒径在2～10nm，表面被十六烷基胺、油酸、十四基膦酸、三辛基氧化膦等覆盖，具有较强的疏水性，优选的量子点组成为(cdse)zns、(cdse)cds、(cds)zns、(cdte)cdse、(cdte)cds、(cdte)zns、(znse)cdse、(inp)zns，发射波长在400nm～800nm之间。
本发明中，所述的两亲性聚合物具有典型的三嵌段结构，即疏水嵌段-交联嵌段-亲水嵌段，其中交联嵌段在未交联前同样具有亲水性，且亲水嵌段的分子量大于疏水嵌段和交联嵌段之和，交联嵌段的分子量最小，不超过整个三嵌段两亲性聚合物分子量的1/10。
本发明中，所述的两亲性聚合物三个嵌段的组成优化如下，疏水嵌段由聚酯类或者聚苯乙烯类聚合物组成，交联嵌段为含有羟基的聚甲基丙烯酸酯或者聚甲基丙烯酰胺类聚合物组成，亲水嵌段为聚乙二醇或者聚乙二醇类的甲基丙烯酸酯，亲水嵌段的末端被羧基、巯基或者氨基封端。
本发明中，所述的三嵌段两亲性聚合物和油溶性量子点通过自组装和交联反应，最终形成具有高稳定性的胶束型水溶量子点，其优化的制备流程如下：
三嵌段两亲性聚合物和油溶性量子点以适当的质量比分散在可以与水互溶的单一组成或者按一定比例混合的有机溶剂中。为保证胶束粒径的均匀，该制备过程中优选在超声波的辅助下，将含有三嵌段两亲性聚合物和油溶性量子点的有机溶剂均匀分散在去离子水中，然后去掉有机溶剂，得到的水溶性量子点在水溶性交联剂作用下，在4℃～37℃的水相环境中引发交联嵌段中羟基之间的交联反应，最后透析除去交联剂，得到表面被羧基、巯基或者氨基完全覆盖的，高稳定性的胶束型水溶量子点。
在上述制备过程中，为控制胶束型水溶量子点的粒径和单个胶束中量子点的数量，三嵌段两亲性聚合物和油溶性量子的质量比被控制在10/1到1/10之间。同时用于分散三嵌段两亲性聚合物和油溶性量子点的单一组成或者按一定比例混合的有机溶剂中，被优化为单一组成的有机溶剂为n，n-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或者四氢呋喃；按一定比例混合的有机溶剂被优化为二甲基甲酰胺/四氢呋喃或者二甲基亚砜/四氢呋喃的混合物，且优选的混合比例为两种溶剂体积比的10/1到1/10之间。
相对于现有的技术，本发明的关键优势在于通过对包裹油溶性量子点的三嵌段两亲性聚合物的结构和组成优化，以及简单的自组装技术和交联反应，即可实现水溶性量子点的量子产率和稳定性的兼顾。特别是三嵌段两亲性聚合物还具有以下两个特点：首先是交联嵌段与亲水嵌段被彻底区分开，在根本上稳固胶束结构的同时，还保证了胶束型水溶性量子点在水相环境中的稳定分散；其次用于交联反应的基团(羟基)和用于生物大分子发生偶联反应的基团(羧基、巯基、氨基)也被彻底区分开，使得交联反应和偶联反应互不干扰，有利于胶束制备过程中交联反应的充分进行从而得到高稳定性的胶束型水溶量子点，也为该高稳定性的胶束型水溶量子点与蛋白质之间偶联反应的充分进行提供了有力保证。
上述优势主要分为以下几个方面：
1、相对比于配体交换法制备的水溶性量子点，本发明涉及的胶束型水溶量子点，具有典型的三层核壳结构，疏水内核中的三嵌段两亲性聚合物是通过疏水相互作用包裹量子点，环绕疏水内核的交联层对整个胶束稳定性起到极大的加固作用，而交联层外的亲水层则保证了胶束型水溶量子点在水相环境中的稳定分散，因此本发明涉及的胶束型水溶性量子点具有比配体置换法制备的水溶性量子点具有更高的胶体稳定性，不受水相环境中ph值和离子强度的影响，更加适用于不同条件下的蛋白质偶联反应。
2、相对比于表面硅烷化的水溶性量子点，本发明涉及的高稳定性胶束型水溶量子点可以高度保持量子点原有的量子产率。这主要是由于本发明涉及的高稳定性胶束型水溶量子点具有以下三个方面的特点。首先，本发明中用于包被油溶性量子点的三嵌段两亲性聚合物为单独制备并纯化，其制备过程中涉及的试剂和反应条件不会对量子点产生任何影响。其次这种胶束型水溶量子点是通过三嵌段两亲性聚合物的疏水链段与油溶性量子点表面疏水配体之间的疏水相互作用而形成，因此两亲性聚合物并不直接接触量子点表面，不会影响量子点的荧光特性。再次，本发明中设计并优化的三嵌段两亲性聚合物，其交联嵌段在交联前具有较强的亲水性，因此交联嵌段中羟基的交联反应主要发生在水相环境中，而量子点已经被包裹在胶束的疏水内核中，与水相环境分离开，因此也不会对疏水内核中的量子点产生影响。综合上述原因，本发明涉及的高稳定性胶束型水溶量子点不会对油溶性量子点的量子产率产生潜在影响，从而显示出较高的标记灵敏度。
3、相对比于梳状两亲性聚合物或者接枝两亲性大分子包被制备的水溶性量子点胶束，本发明涉及的高稳定性胶束型水溶量子点，是利用具有线性结构的三嵌段两亲性聚合物包被油溶性量子点。由于线性聚合物在结构上比梳状聚合物或者接枝聚合物更加简单，且可精确调控各嵌段的组成和长度，特别是控制交联嵌段的链段长度和交联基团的数量，从而得到单层或者多层的网状交联层，从而全面提高了胶束型水溶量子点的稳定性。
4、相对比于两嵌段的两亲性线性聚合物包被制备的水溶性量子点胶束，本发明涉及的高稳定性胶束型水溶量子点，是利用具有线性结构的三嵌段两亲性聚合物包被油溶性量子点。相比较于两嵌段的两亲性线性聚合物，三嵌段两亲性聚合物可以使交联嵌段与亲水嵌段被彻底区分开，同时用于交联反应的基团(羟基)和用于生物大分子发生偶联反应的基团(羧基、巯基、氨基)也被彻底区分开。因此该发明所涉及的胶束型水溶量子点中，交联反应和偶联反应各自单独进行，互不干扰。所以本发明所涉及的胶束型水溶量子点可以通过充分的交联反应得到具有一定强度和厚度的交联层。从而保证其高稳定性。同时，覆盖在高稳定的胶束型水溶量子点表面的，可以与大分子蛋白质发生偶联的基团仍保持原有的数量和活性，为该高稳定性的胶束型水溶量子点与蛋白质之间偶联反应的充分进行提供了有力保证。
附图说明
图1为本发明所述高稳定性胶束型水溶量子点的制备示意图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
实施例1：
步骤1油溶性量子点(cdse)zns的制备：
根据文献[j.j.li，y.a.wang，w.z.guo，etal.j.am.chem.soc.2003，125，12567-12575]合成油溶性量子点(cdse)zns，粒径在4～5nm之间，表面三辛基氧化膦覆盖，呈现强疏水性。
步骤2三嵌段两亲性聚合物的制备：
通过分步的原子转移自由基聚合反应，得到三嵌段的两亲性聚合物聚苯乙烯-聚甲基丙烯酸羟乙酯-聚乙二醇甲基醚甲基丙烯酸酯，其中聚苯乙烯为疏水嵌段，聚甲基丙烯酸羟乙酯为含有侧链羟基的交联嵌段，聚乙二醇甲基醚甲基丙烯酸酯为亲水嵌段，聚乙二醇甲基醚甲基丙烯酸酯的末端为羧基修饰。该三嵌段两亲性聚合物的分子量在9500-10500，其中含有侧链羟基的亲水交联嵌段聚甲基丙烯酸羟乙酯的分子量在800左右。
步骤3：
称取10mg的三嵌段两亲性聚合物聚苯乙烯-聚甲基丙烯酸羟乙酯-聚乙二醇甲基醚甲基丙烯酸酯和10mg的量子点(cdse)zns，分散在5ml的二甲基亚砜/四氢呋喃(体积比1/1)的混合溶剂中，得到有机相。然后在超声条件下将该有机相分散在去离子水中，通过透析除去有机溶剂，得到水溶性的量子点胶束。然后按照投入三嵌段两亲性聚合物中交联嵌段的分子量计算出交联剂戊二醛的用量并加入量子点胶束水溶液中，室温下反应4小时。反应结束后通过透析除去戊二醛，在1l的水中透析24小时，每3小时换透析液一次。透析结束后，收集透析袋中形成的胶束型量子点水溶液，高速离心，得到沉淀经20小时冷冻干燥，得到粉末状固体，即得到高稳定性的胶束型水溶性量子点。将该粉体溶于去离子水中，用动态激光光散射仪测定胶束的粒径分布在45-50nm左右，多分散性为0.029。tem照片显示胶束型量子点的平均粒径为30-40nm，呈球形，分散均匀，每个胶束内分布量子点3-5个。
室温条件下将该胶束型水溶性量子点以一定浓度(0.1mg/ml)分散在不同ph值(ph＝4.01、6.86、9.18)的缓冲液中，连续3周每3天观察其分散状态并测定其粒径的变化(如表1)，发现该胶束型水溶性量子点对ph值不敏感，可在不同ph值环境中保持稳定分散的状态，且荧光强度不变。
(表1)
实施例2：
步骤1油溶性量子点(znse)cdse的制备：
根据文献[x.h.zhong，r.g.xie，y.zhang，etal.chem.mater.2005，17，4038-4042.]合成油溶性量子点(znse)cdse，粒径在6-7nm之间，表面三辛基氧化膦覆盖，呈现强疏水性。
步骤2三嵌段两亲性聚合物的制备：
通过开环聚合、酯化反应、点击化学和可逆加成-断裂链转移聚合反应，得到三嵌段两亲性聚合物聚己内酯-聚甲基丙烯酸羟丙酯-聚乙二醇，其中聚己内酯为疏水嵌段，聚甲基丙烯酸羟丙酯为含有侧链羟基的交联嵌段，聚乙二醇为亲水嵌段，聚乙二醇的末端为羧基修饰。该三嵌段两亲性聚合物的分子量在16000～20000，其中含有侧链羟基的亲水交联嵌段聚甲基丙烯酸羟乙酯的分子量在1000～1200左右。
步骤3：
称取8mg的三嵌段两亲性聚合物聚己内酯-聚甲基丙烯酸羟丙酯-聚乙二醇和20mg的量子点(znse)cdse，分散在5ml的nn二甲基甲酰胺/四氢呋喃(体积比1/4)的混合溶剂中，得到有机相。然后在超声条件下将该有机相分散在去离子水中，然后在超声条件下将该有机相分散在去离子水中，通过透析除去有机溶剂，得到水溶性的量子点胶束。然后按照投入三嵌段两亲性聚合物中交联嵌段的分子量计算出交联剂戊二醛的用量并加入量子点胶束水溶液中，室温下反应4小时。反应结束后通过透析除去戊二醛，在1l的水中透析24小时，每3小时换透析液一次。透析结束后，收集透析袋中形成的胶束型量子点水溶液，高速离心，得到沉淀经20小时冷冻干燥，得到粉末状固体。用动态激光光散射仪测定胶束型水溶量子点的粒径在70-80nm，多分散性为0.034。tem照片显示胶束型量子点的平均粒径为60nm，呈球形，分散均匀，每个胶束内分布量子点6-9个。
室温条件下将该胶束型水溶性量子点以一定浓度(0.1mg/ml)分散在不同离子强度(0.01m、0.1m、1m和2m)的pbs缓冲液(ph＝7.4)中，连续3周每3天观察其分散状态并测定其粒径的变化(如表2)，发现该胶束型水溶性量子点对离子强度不敏感，可在不同离子强度的pbs缓冲液中保持稳定分散的状态，且荧光强度不变。
(表2)
实施例3：高稳定性胶束型水溶量子点-大分子抗体偶联体的制备和纯化
选用人心肌钙蛋白i(ctni)单克隆抗体(anti-ctni，分子量≈150kd)作为被偶联的大分子蛋白质的模型，选用实施例1所制备的表面羧基封端的高稳定性胶束型水溶量子点，制备可用于心脏疾病诊断的量子点-ctni单抗偶联体。
先配置如下溶液备用：
edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)溶液的配制(0.052m，10mg/ml)：取1mg的edc溶于100μl的pbs中(0.1m，ph＝7.27)。
nhs(n-羟基丁二酰亚胺)溶液的配制(0.087m，10mg/ml)：取1mg的nhs溶于100μl的pbs中(0.1m，ph＝7.27)。
具体反应过程如下：
取20μl的表面羧基封端的高稳定性胶束型水溶量子点(8μm)，加60μl的硼酸盐缓冲液(0.05m，ph＝6.0)，室温下涡旋使溶液混匀，然后震荡30分钟，活化量子点表面羧基，然后加入naoh(0.1m)调节溶液的ph值至中性(ph＝7.27)。按照一定的摩尔比(edc/量子点＝20/1和nhs/量子点＝20/1)，向活化后的高稳定性胶束型水溶量子点中加入edc和nhs溶液，再涡旋15分钟使其充分混合均匀。紧接着，向反应体系中加入一定体积的抗体水溶液(抗体/量子点的摩尔比＝1∶1)。再次涡旋15分钟充分混合后，将反应体系避光且放入振荡器中室温振荡2小时，振荡结束后放4℃冰箱过夜，过夜后离心除去未偶联的抗体分子，所得的胶束型量子点-ctni单抗偶联体重新溶解在pbs中备用，其回收率在95％左右。通过电泳检测，胶束型水溶性量子点与单克隆抗体的偶联效率在98％以上。
实施例4：高稳定性胶束型水溶量子点-大分子糖蛋白偶联体的制备和纯化
选用癌胚抗原(carcinoembryonicantigen，cea，分子量≈180kd)作为被偶联的大分子蛋白质的模型，选用实施例2所制备的表面羧基封端的高稳定性胶束型水溶量子点，制备胶束型水溶量子点-糖蛋白偶联体。
先配置如下溶液备用：
cea溶液(1mg/ml)：取0.5mg的cea溶解在0.5ml的pbs中(0.1m，ph＝7.27)。
过碘酸钠溶液的配置(0.1m)：取21.4mg的过碘酸钠溶于1ml的超纯水中，避光保存。
己二酸二酰肼(adipicaciddihydrazide，adh)溶液的配置(0.029m，5mg/ml)：取1mg的nhs溶于200μl的pbs中(0.1m，ph＝7.27)。
具体反应过程如下：
取10μl的过碘酸钠溶液加入100μl的cea溶液(1mg/ml)中，避光室温下反应30分钟，然后避光过夜透析除去多余的过碘酸钠，得到含有大量醛基的cea。
取20μl的表面羧基封端的高稳定性胶束型水溶量子点(8μm)，加60μl的硼酸盐缓冲液(0.05m，ph＝6.0)，室温下涡旋使溶液混匀，然后震荡30分钟，活化量子点表面羧基，然后加入naoh(0.1m)调节溶液的ph值至中性(ph＝7.27)。用pbs稀释整个反应体系，使整个溶液体积达到1ml，再加入2μl的edc溶液(0.052m)和5μl的adh溶液(0.029m)，充分混合后室温下反应4小时。反应结束后，充分透析除去多余的edc和adh，从而得到表面酰肼修饰的胶束型水溶量子点。
将酰肼修饰的胶束型水溶量子点与氧化处理过的cea(摩尔比为1/2)充分混合，室温下避光，在振荡器中振荡2.5～4小时，振荡结束后放4℃冰箱过夜。过夜后冻干液体，得到的粉体重新分散在适量pbs中，离心除去未偶联的抗体分子，所得的量子点-cea偶联体重新溶解在pbs中备用，其回收率在98％左右。通过电泳检测，胶束型水溶性量子点与cea的偶联效率在95％左右。
上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围。