一种分子影像探针及其应用的制作方法

本发明涉及分子影像技术领域，尤其涉及一种分子影像探针及其应用。

背景技术

分子影像学(molecularimaging)是运用影像学手段显示组织水平、细胞和亚细胞水平的特定分子，反映活体状态下分子水平变化，对其生物学行为在影像方面进行定性和定量研究的科学。因此，分子影像学是将分子生物学技术和现代医学影像学相结合的产物，而经典的影像诊断(x线、ct、mr、超声等)主要显示的是一些分子改变的终效应，具有解剖学改变的疾病；而分子影像学通过发展新的工具、试剂及方法，探查疾病过程中细胞和分子水平的异常，在尚无解剖改变的疾病前检出异常，为探索疾病的发生、发展和转归，评价药物的疗效中，起到连接分子生物学与临床医学之间的桥梁作用。

近红外光谱(nir)主要是由于分子振动的非谐振性使分子振动从基态向高能级跃迁时产生的，记录的主要是含氢基团c－h、o－h、n－h、s－h、p－h等振动的倍频和合频吸收。不同基团(如甲基、亚甲基、苯环等)或同一基团在不同化学环境中的近红外吸收波长与强度都有明显差别，所以近红外光谱具有丰富的结构和组成信息，非常适合用于碳氢有机物质的组成性质测量。

膀胱癌是泌尿系统肿瘤中发病率最高的一类肿瘤，并且膀胱癌术后复发率高，据2016年发表的文献报道(europeanassociationofurologyguidelines,2016；europeanassociationofurologyguidelines，2016)，术后即使进行辅助治疗，膀胱肿瘤一年复发率也可达15％-61％，术后五年复发率可达50％-70％。目前手术切除肿瘤为主要手段，膀胱组织整体切除，患者术后生活质量严重下降；部分切除或者微创手术，部分微小病灶难以发现，存在漏切、多切等情况。现有术前诊断技术如b超、ct、mri等的特异性和敏感性有待提高：对于<8mm的肿瘤敏感性下降，难以在分子水平成像，并且只能提供术前的诊断，不能实现术中实时成像导航。对膀胱癌患者进行手术切除，无论是开放式或者是微创手术，均凭借术前诊断结果，手术对医生经验依赖度极高，并且难以精准切除肿瘤组织，尤其是浸润性肿瘤，对于微小病灶更是难以发现，这样就造成了术后复发率居高不下。cn103361403a公开了一种检测膀胱癌相关风险基因的试剂盒，该试剂盒包括同时检测myc基因上的rs9642880号snp位点和psca基因上的rs2294008号snp位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、用于荧光定量pcr检测的常规组件等，该发明通过同时检测与myc和psca的单核苷酸多态性位点基因型来评估个体罹患膀胱癌的风险性，但该试剂盒检测手段复杂，无法实现肿瘤定位和成像。

因此，研发一种靶向特异性识别肿瘤的探针，在细胞级别对重量进行精确定位，并提供术中实时可视化近红外成像，能大大提高手术精准度和成功率，降低术后复发，提供患者术后生活质量，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

技术实现要素：

针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种分子影像探针，所述所述分子影像探针通过特异性靶向部分识别肿瘤细胞，通过“组装滞留效应(air)”在肿瘤微环境组装滞留，实现在肿瘤组织高量和长效成像，通过近红外光激发，实现在肿瘤病灶部位的稳定、长效术中成像导航，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种分子影像探针，所述分子影像探针为多肽类分子，包括位于一端的特异性靶向部分、中间的响应组装滞留部分和侧链的显色部分；

其中，所述响应组装滞留部分包括响应序列和组装序列，所述响应序列为seqidno.1，具体为g-p-x，即gly-pro-x，所述组装序列为seqidno.2，具体为k-l-v-f-f，即lys-leu-val-phe-phe。

本发明中，采用了发明人独创的“组装滞留效应”(assembly/aggregationinducedretention,air)技术，通过特异性靶向部分识别肿瘤细胞表面过表达的整合素αvβ5，引导探针通过主动靶向结合作用在肿瘤细胞表面富集；在肿瘤微环境中，被肿瘤相关层纤维细胞表面fap-α蛋白进行分子剪切后，响应组装滞留部分在肿瘤微环境中原位形成β-sheet纤维组装体，实现荧光染料分子在肿瘤部位的聚集滞留，增强荧光分子成像稳定性，延长成像时间，提高了荧光分子的肿瘤递送效率，增强肿瘤的成像灵敏度，可实现微小病灶(<2mm)的成像诊断，应用现有的光学分子影像手术导航系统可视化成像，可实现肿瘤组织细胞级别精确定位，并且能实时高灵敏成像，为手术医生指引肿瘤切除位置，极大提高了手术的成功率。

本发明中，所述响应序列为gly-pro-x，其中x为任意氨基酸，被fap-α蛋白剪切部位为gly-pro与x的连接处。

其中，所述x例如可以是g、a、v、l、i、f、p、s、t、h、w、c、d、e、k、y、m、n、q或r。

优选地，所述响应序列为seqidno.3，具体为g-p-a，即gly-pro-ala。

优选地，所述响应组装滞留部分为seqidno.4，具体为g-p-a-k-l-v-f-f-c-t多肽序列，即gly-pro-ala-lys-leu-val-phe-phe-cys-thr多肽序列。

优选地，所述特异性靶向部分包括rgd和/或crgd，优选为rgd。

所述特异性靶向部分的多肽序列为seqidno.5，具体为r-g-d，即arg-gly-asp(rgd)或者环肽(crgd)。

优选地，所述靶向部分靶向的肿瘤包括乳腺癌、肺癌、胰腺癌或胃癌中的任意一种或至少两种的组合，优选为膀胱癌。

所述的分子影像探针靶向特异性不限于膀胱癌，对于其它肿瘤也具有靶向特异性，实现实时可视化的成像。

优选地，所述侧链的显色部分包括荧光发射波段500nm以上的亲水性荧光染料，优选为近红外荧光染料分子。

其中，所述荧光发射波段为500nm以上，例如可以是500nm、550nm、580nm、600nm、680nm、700nm或800nm。

其中，所述近红外荧光染料分子包括ir783和/或ir820，优选为ir783。

优选地，所述侧链的显色部分与中间的响应组装滞留分子部分通过半胱氨酸侧链巯基进行定位修饰。

优选地，所述分子影像探针还包括亲水部分。

优选地，所述亲水部分为乙酰氨基葡萄糖修饰的氨基酸组成的多肽，乙酰氨基葡萄糖修饰的氨基酸包括ser或者thr，优选为ser。

优选地，所述多肽的序列包括ser(o-glcnac)-gly-ser(o-glcnac)和/或thr(o-glcnac)-gly-thr(o-glcnac)，优选为ser(o-glcnac)-gly-ser(o-glcnac)。

优选地，所述分子影像探针的多肽序列为ser(o-glcnac)-gly-ser(o-glcnac)-gly-pro-ala-lys-leu-val-phe-phe-cys(ir783)-thr-arg-gly-asp。

所述分子影像探针具有如式i所示的结构：

所述分子影像探针述的分子影像探针具有光学分子影像特征，通过盥洗或者静脉注射到患者体内，在病灶部位通过近红外波段(680-800nm)激光激发，实现近红外成像，引导术中准确切除肿瘤。

第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的分子影像探针用于制备肿瘤的术前诊断和/或术后复查的试剂和/或试剂盒。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明提供的分子影像探针能够提高荧光分子的光稳定性，实现探针在肿瘤部位的高量、长效富集，能精确定位肿瘤细胞，将实现可视化定位肿瘤，提高医生肿瘤切除的精准性，大大提高手术成功率，降低了术后复发率，提高患者术后生活质量；

(2)本发明提供的分子影像探针实现的术中导航可以清晰刻画肿瘤边界，为医生切除肿瘤、明确瘤体切缘提供可视化依据；此外，该探针可以实现超过12小时的长效成像，实时荧光成像的荧光信号衰减不超过10％，为复杂手术的长时间实时成像提供清晰影像；最后，该探针的成像灵敏度高，可以实现对直径小于2mm的微小病灶的清晰成像，为医生手术清除微小病灶，降低术后复发，提供有力技术支持。

附图说明

图1是本发明的分子影像探针与临床使用的icg对比图；

图2是本发明的分子影像探针膀胱癌细胞ej的靶向富集图；

图3是本发明的分子影像探针在离体膀胱肿瘤组织和正常膀胱组织中的特异性选择性结果图；

图4是本发明的分子影像探针在小鼠人移行膀胱癌ej微小病灶模型中静脉给药成像图；

图5是本发明的分子影像探针在小鼠人移行膀胱癌ej和rt-112的原位模型盥洗给药成像图，其中，坐标尺为colorscale(比色刻度尺)，min为7000，max为13000。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

实施例1分子影像探针的制备

本实施例通过以下方法制备分子影像探针：

该分子影像探针以rgd为特异性靶向识别部分，以gpaklvffct为响应组装滞留部分，侧链近红外荧光染料分子为ir783，分子结构如式i所示，合成制备步骤如下：

(1)采用fmoc固相合成法，选用wang树脂的修饰密度为0.35mm，在树脂上合成所述多肽，用六氢吡啶的dmf溶液脱去氨基端的fmoc保护，将下一个氨基酸的羧基用4-甲基吗啉和苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯的dmf溶液进行活化，然后与脱保护的第一个氨基酸进行缩合反应，重复上述步骤，直到完成所有氨基酸的缩合；

(2)其中ser(o-glcnac)fmoc的合成步骤与步骤(1)中的氨基酸链接方法一致；

(3)将所述合成的多肽用含有2.5％水和2.5％三异丙基硅烷的三氟乙酸溶液将合成好的多肽从树脂上脱除，同时脱除氨基酸的侧链保护；将三氟乙酸用旋转蒸发法去除，然后多肽的粗产物用无水乙醚沉淀，洗涤并干燥；最后选用反相制备液相色谱，将多肽纯化；

(4)将ir783分子在ph7.5-8.5的tris缓冲液中与步骤(3)得到的多肽上cys侧链巯基进行偶联反应，避光室温搅拌反应过夜后，通过透析将未反应的ir783进行分离，随后将透析液蒸发浓缩萃取后，得到最终分子ser(o-glcnac)-gly-ser(o-glcnac)-gly-pro-ala-lys-leu-val-phe-phe-cys(ir783)-thr-arg-gly-asp。

实施例2分子影像探针的制备

本实施例通过以下方法制备分子影像探针：

该分子影像探针以rgd为特异性靶向识别部分，以gpvklvffct为响应组装滞留部分，侧链近红外荧光染料分子为ir783，分子结构如式i所示，合成制备步骤如下：

(1)采用fmoc固相合成法，选用wang树脂的修饰密度为0.35mm，在树脂上合成所述多肽，用六氢吡啶的dmf溶液脱去氨基端的fmoc保护，将下一个氨基酸的羧基用4-甲基吗啉和苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯的dmf溶液进行活化，然后与脱保护的第一个氨基酸进行缩合反应，重复上述步骤，直到完成所有氨基酸的缩合；

(2)其中ser(o-glcnac)fmoc的合成步骤与步骤(1)中的氨基酸链接方法一致；

(3)将所述合成的多肽用含有2.5％水和2.5％三异丙基硅烷的三氟乙酸溶液将合成好的多肽从树脂上脱除，同时脱除氨基酸的侧链保护；将三氟乙酸用旋转蒸发法去除，然后多肽的粗产物用无水乙醚沉淀，洗涤并干燥；最后选用反相制备液相色谱，将多肽纯化；

(4)将ir783分子在ph7.5-8.5的tris缓冲液中与步骤(3)得到的多肽上cys侧链巯基进行偶联反应，避光室温搅拌反应过夜后，通过透析将未反应的ir783进行分离，随后将透析液蒸发浓缩萃取后，得到最终分子ser(o-glcnac)-gly-ser(o-glcnac)-gly-pro-val-lys-leu-val-phe-phe-cys(ir783)-thr-arg-gly-asp。

实施例3分子影像探针的制备

本实施例通过以下方法制备分子影像探针：

该分子影像探针以rgd为特异性靶向识别部分，以gplklvffct为响应组装滞留部分，侧链近红外荧光染料分子为ir783，分子结构如式i所示，合成制备步骤如下：

(1)采用fmoc固相合成法，选用wang树脂的修饰密度为0.35mm，在树脂上合成所述多肽，用六氢吡啶的dmf溶液脱去氨基端的fmoc保护，将下一个氨基酸的羧基用4-甲基吗啉和苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯的dmf溶液进行活化，然后与脱保护的第一个氨基酸进行缩合反应，重复上述步骤，直到完成所有氨基酸的缩合；

(2)其中thr(o-glcnac)fmoc的合成步骤与步骤(1)中的氨基酸链接方法一致；

(3)将所述合成的多肽用含有2.5％水和2.5％三异丙基硅烷的三氟乙酸溶液将合成好的多肽从树脂上脱除，同时脱除氨基酸的侧链保护；将三氟乙酸用旋转蒸发法去除，然后多肽的粗产物用无水乙醚沉淀，洗涤并干燥；最后选用反相制备液相色谱，将多肽纯化；

(4)将ir783分子在ph7.5-8.5的tris缓冲液中与步骤(3)得到的多肽上cys侧链巯基进行偶联反应，避光室温搅拌反应过夜后，通过透析将未反应的ir783进行分离，随后将透析液蒸发浓缩萃取后，得到最终分子thr(o-glcnac)-gly-thr(o-glcnac)-gly-pro-leu-lys-leu-val-phe-phe-cys(ir783)-thr-arg-gly-asp。

实施例4分子影像探针的测试

(1)采用实施例1制备得到的分子影像探针与临床使用的icg进行对比实验，通过同样条件下激光的连续激发，得到不同时间点的荧光发射最大吸收峰强度，将强度归一化与时间点进行作图，结果如图1所示，；

由图1可知，随着激光的连续激发，实施例1制备得到的nir分子探针具有较强的光稳定性和抗光漂白的能力，可以实现在15小时内的连续激发成像。

(2)将实施例1制备得到的分子影像探针与人移行膀胱癌ej细胞共同培养，本发明的分子影像探针具有主动靶向和组装滞留效应，与只具有主动靶向的分子探针对比，结果如图2所示；

由图2可知，本发明的分子影像探针在肿瘤细胞聚集，成像效果更佳。

(3)将离体的膀胱癌组织和正常的膀胱组织在4℃条件下，bsa封闭90分钟；然后在37℃的条件下，模拟正常人体温度，用实施例1制备得到的分子影像探针分别浸泡膀胱癌组织和正常膀胱组织60分钟；用tbst冲洗，10分钟每次，冲洗3次；最后，制备冰冻切片样本并切片，厚度15μm，通过切片观察，结果如图3所示；

由图3可知，本发明的分子影像探针具有膀胱肿瘤细胞特异性识别，能够准确定位识别肿瘤组织。

(4)将实施例1制备得到的分子影像探针以尾静脉注射的方式注射到小鼠人移行膀胱癌ej微小病灶模型中，可以在小鼠体内实现特异性的膀胱肿瘤成像，结果如图4所示；

由图4可知，结果表明该分子影像探针的特异性靶向识别以及组装滞留效应能原位实现肿瘤病灶成像，并且实现长效成像。

(5)将实施例1制备得到的分子影像探针以膀胱盥洗的方式用在小鼠人移行膀胱癌ej和rt-112的原位模型中，具体的操作步骤如下：将本发明的分子影像探针0.1-0.2ml注入小鼠膀胱，滞留1小时，排空膀胱后用生理盐水冲洗，10分钟每次，冲洗3次，在活体小动物成像仪器下观察分子与膀胱癌的靶向能力，并且做病理切片h&e染色，结果如图5所示；

由图5可知，结果表明本发明的分子影像探针具有很好的分子靶向特性，在膀胱肿瘤部位组装滞留富集，并且h&e染色证实了靶向部位为膀胱癌。

实施例5手术应用方法

将实施例1制备得到的分子影像探针应用到人离体膀胱组织中，通过膀胱盥洗的方式，将分子影像探针注入膀胱，滞留1小时后，排空膀胱并用生理盐水冲洗3次，用临床使用的荧光探头实现肿瘤组织可视化成像，从而可以实现术中的精准导航。

综上所述，本发明提供的分子影像探针通过特异性靶向部分识别肿瘤细胞，通过“组装滞留效应(air)”在肿瘤微环境组装滞留，实现在肿瘤组织高量和长效成像，通过近红外光激发，实现在肿瘤病灶部位的稳定、长效术中成像导航，实现可视化定位肿瘤，提高医生肿瘤切除的精准性，大大提高手术成功率，降低了术后复发率，提高患者术后生活质量。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

sequencelisting

<110>国家纳米科学中心

<120>一种分子影像探针及其应用

<130>2018年

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