脲酶-金纳米团簇荧光材料及其制备方法与流程

本发明涉及脲酶-金纳米团簇荧光材料及其制备方法，属于纳米技术领域。

背景技术

近年来，荧光金属纳米团簇作为一种新型的荧光纳米材料备受关注。金属纳米团簇是指在一定的分子层保护作用下，由几个到几百个金属原子构成的分子级聚集体。由于其独特的物理、电学和光学性质，金属纳米团簇在单分子光电、催化、生物成像和传感器等领域显示出广泛的应用前景。在所有的金属纳米团簇材料中，金纳米团簇（goldnanoclusters，auncs）因其具有化学性质稳定和生物相容性好等优点，是目前研究最多的一种金属纳米团簇材料。

生物体通过摄取金属离子从而形成矿物结构这一行为被称为生物矿化，它是一个自然的过程，是机体逃避有毒金属离子不良影响的重要机制。受这一过程启发，一些研究成果已经表明通过生物体或生物大分子对无机材料的摄取和排列可以合成出纳米材料。蛋白质具有良好的尺寸调控能力，通过其分子内的残基结构可以很容易制备得到纳米材料。因此，将蛋白质和金属前驱体结合已经发展成为金属纳米团簇合成的一个重要分支。2009年，xie等首次利用牛血清白蛋白（bsa）的模板作用通过模拟生物矿化作用成功制备得到含25个金原子的auncs。在碱性条件下，蛋白质中的芳香族氨基酸残基可以还原氯金酸形成金核，而二硫键的打开可以为金核提供良好的稳定作用。到目前为止，除bsa外，研究者们还发现其他蛋白质，如人血清蛋白、转铁蛋白、胰蛋白酶、胃蛋白酶、溶菌酶、辣根过氧化物酶和胰岛素等，也可制备得到auncs。与其他auncs制备方法相比，蛋白质生物模板法制备方法简单、反应条件温和，不需要添加任何外源还原剂，所制得的auncs稳定性高、生物相容性好，且其最大发射波长通常位于近红外区域，因此在医学和传感器等领域研究中具有巨大的应用前景。

本发明在无添加任何其他还原剂的条件下，以脲酶为生物模板原位合成金纳米团簇荧光材料。脲酶作为稳定剂和还原剂控制金纳米团簇的形成。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种脲酶-金纳米团簇荧光材料及其在无添加任何其他还原剂的条件下，以脲酶为生物模板原位合成金纳米团簇荧光材料的方法。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明所述的脲酶-金纳米团簇荧光材料的制备方法，其特征是由以下反应步骤制成：将浓度为0.2~0.2mol/l的氢氧化钠溶液和氯金酸溶液依次加入到浓度为0~50mg/ml的脲酶溶液中，混匀，置于37°c水浴恒温反应0~12小时，反应结束后用截留分子量为7000的透析袋对反应液进行透析纯化处理，得到脲酶-金纳米团簇荧光材料水溶液，脲酶-金纳米团簇荧光材料水溶液冷冻干燥后可得到脲酶-金纳米团簇荧光材料粉末，脲酶是作为稳定剂和还原剂控制金纳米团簇的形成，所述氢氧化钠溶液、氯金酸溶液和脲酶溶液的体积比为1：4：4，三者总体积为45ml。

所用的氢氧化钠溶液的浓度和体积为1mol/l和5ml，氯金酸溶液的浓度和体积为10mmol/l和20ml，脲酶溶液的浓度和体积为50mg/ml和20ml，反应时间为12小时，反应温度为37°c。

本发明的上述的方法制得的脲酶-金纳米团簇荧光材料，其特征是脲酶-金纳米团簇荧光材料水溶液为淡棕色，紫外-可见光谱在280nm处出现蛋白质的特征吸收峰，在紫外灯照射下产生强烈的红色荧光，最大激发波长和发射波长分别为490nm和630nm，量子产率为17%，荧光寿命为1.74μs。

所述的脲酶-金纳米团簇荧光材料水溶液置于4℃暗处保存一个月后，相对荧光强度保持在85%以上。

所述的脲酶-金纳米团簇荧光材料水溶液置于0.2~2mol/l氯化钠溶液中孵育30分钟后，相对荧光强度保持在90%以上。

所述的脲酶-金纳米团簇荧光材料水溶液置于10%人血清中孵育30分钟后，相对荧光强度保持在90%以上。

本发明未添加任何其他还原剂，脲酶作为稳定剂和还原剂控制金纳米团簇的形成。

本发明具体的脲酶-金纳米团簇荧光材料的制备：以下过程中使用的所有玻璃器皿均经过王水浸泡，并用双蒸水彻底清洗，晾干。脲酶-金纳米团簇荧光材料的制备方法如下：将浓度为5ml浓度为1mol/l的naoh溶液与20ml浓度为10mmol/l氯金酸依次加入到20ml浓度为50mg/ml新鲜配制的脲酶溶液中，混匀后置于37℃恒温水浴槽中孵育8小时。待反应结束后用分子量为7000的透析袋对反应液透析纯化48小时，得到脲酶-金纳米团簇荧光材料水溶液。

本发明的优点：

（1）本发明在无添加任何其他还原剂的条件下，以脲酶为生物模板原位合成金纳米团簇荧光材料。制备方法绿色环保，操作简便快捷，重现性好。

（2）本发明所制备的脲酶-金纳米团簇具有强烈的红色荧光（最大发射波长为630nm），长荧光寿命（1.74μs），高稳定性（时间、盐及血清稳定性）及较大的斯托克斯位移（140nm）等特点。

附图说明

图1为脲酶-金纳米团簇荧光纳米材料分别在可见光（a）和紫外灯下（b）的外观对比图。

图2为脲酶-金纳米团簇荧光纳米材料的紫外-可见吸收光谱图。

图3为脲酶-金纳米团簇荧光纳米材料的荧光光谱图。

图4为脲酶浓度对脲酶-金纳米团簇荧光强度的影响图。

图5为氢氧化钠浓度对脲酶-金纳米团簇荧光强度的影响图。

图6为反应时间对金纳脲酶-米团簇荧光强度的影响图。

图7为脲酶-金纳米团簇荧光纳米材料的透射电镜图。

图8为脲酶-金纳米团簇荧光纳米材料的能量散射x射线能谱图。

图9为脲酶-金纳米团簇荧光纳米材料的荧光寿命图。

图10为脲酶-金纳米团簇荧光纳米材料的x射线光电子能谱图。图中：a为金的4f图，b为硫的2p图。

图11为脲酶-金纳米团簇的时间稳定性图。

图12为脲酶-金纳米团簇的盐稳定性图。

图13为脲酶-金纳米团簇的血清稳定性图。

具体实施方式

实例1：

将浓度为5ml浓度为1mol/l的naoh溶液与20ml浓度为10mmol/l氯金酸依次加入到20ml浓度为50mg/ml新鲜配制的脲酶溶液中，混匀后置于37℃恒温水浴槽中孵育8小时。待反应结束后用分子量为7000的透析袋对反应液透析纯化48小时，得到脲酶-金纳米团簇荧光材料水溶液。所得到的脲酶-金纳米团簇溶液可见光下为淡棕色（见图1中的a），紫外灯照射下产生强烈的红色荧光（见图1中的b），紫外-可见光谱在280nm处出现蛋白质的特征吸收峰（见图2），最大激发波长和发射波长分别为490nm和630nm（见图3），量子产率为17%。

实例2：

将浓度为5ml浓度为1mol/l的naoh溶液与20ml浓度为10mmol/l氯金酸依次加入到20ml浓度为0~80mg/ml（0~80mg/ml中的0指大于0mg/ml，可以是0.01mg/ml，即20ml浓度为0.01mg/ml~80mg/ml的）新鲜配制的脲酶溶液中，混匀后置于37℃恒温水浴槽中孵育8小时。待反应结束后用分子量为7000的透析袋对反应液透析纯化48小时，得到脲酶-金纳米团簇荧光材料水溶液。如图4所示，溶液在630nm处的荧光强度值（f630）在脲酶溶液浓度为50mg/ml时达到最大。

实例3：

将浓度为5ml浓度为0.2~2mol/l的naoh溶液与20ml浓度为10mmol/l氯金酸依次加入到20ml浓度为50mg/ml新鲜配制的脲酶溶液中，混匀后置于37℃恒温水浴槽中孵育8小时。待反应结束后用分子量为7000的透析袋对反应液透析纯化48小时，得到脲酶-金纳米团簇荧光材料水溶液。如图5所示，溶液在630nm处的荧光强度值（f630）在氢氧化钠溶液浓度为1mol/l时达到平衡。

实例4：

将浓度为5ml浓度为1mol/l的naoh溶液与20ml浓度为10mmol/l氯金酸依次加入到20ml浓度为50mg/ml新鲜配制的脲酶溶液中，混匀后置于37℃恒温水浴槽中孵育0~12小时（0~12小时中的0指大于0小时，可以是30秒，即30秒~12小时）。待反应结束后用分子量为7000的透析袋对反应液透析纯化48小时，得到脲酶-金纳米团簇荧光材料水溶液。如图6所示，溶液在630nm处的荧光强度值（f630）在在反应时间为8小时时达到最大。

实例5：

将浓度为5ml浓度为1mol/l的naoh溶液与20ml浓度为10mmol/l氯金酸依次加入到20ml浓度为50mg/ml新鲜配制的脲酶溶液中，混匀后置于37℃恒温水浴槽中孵育8小时。待反应结束后用分子量为7000的透析袋对反应液透析纯化48小时，得到脲酶-金纳米团簇荧光材料水溶液。将所得溶液滴涂在铜网上。透射电镜分析（见图7）表明脲酶-金纳米团簇的粒径约为2.4nm。能量散射x射线能谱分析（见图8）表明产物含有金。

实例6：

将浓度为5ml浓度为1mol/l的naoh溶液与20ml浓度为10mmol/l氯金酸依次加入到20ml浓度为50mg/ml新鲜配制的脲酶溶液中，混匀后置于37℃恒温水浴槽中孵育8小时。待反应结束后用分子量为7000的透析袋对反应液透析纯化48小时，得到脲酶-金纳米团簇荧光材料水溶液。将所得的溶液进行荧光寿命测定，测得脲酶-金纳米团簇的荧光寿命值为1.74μs（见图9）。

实例7：

将浓度为5ml浓度为1mol/l的naoh溶液与20ml浓度为10mmol/l氯金酸依次加入到20ml浓度为50mg/ml新鲜配制的脲酶溶液中，混匀后置于37℃恒温水浴槽中孵育8小时。待反应结束后用分子量为7000的透析袋对反应液透析纯化48小时，得到脲酶-金纳米团簇荧光材料水溶液。将所得溶液冷冻干燥后得到粉末，取所得粉末进行x射线光电子能谱测定，在84.4ev和88.1ev处出现金的4f峰，在162.9ev和163.8ev处出现硫的2p峰（见图10中的a为金的4f图，b为硫的2p图）。

实例8：

将浓度为5ml浓度为1mol/l的naoh溶液与20ml浓度为10mmol/l氯金酸依次加入到20ml浓度为50mg/ml新鲜配制的脲酶溶液中，混匀后置于37℃恒温水浴槽中孵育8小时。待反应结束后用分子量为7000的透析袋对反应液透析纯化48小时，得到脲酶-金纳米团簇荧光材料水溶液。将所得溶液置于4℃暗处保存一个月后，脲酶-金纳米团簇的相对荧光强度为85.7%（图11）。

实例9：

将浓度为5ml浓度为1mol/l的naoh溶液与20ml浓度为10mmol/l氯金酸依次加入到20ml浓度为50mg/ml新鲜配制的脲酶溶液中，混匀后置于37℃恒温水浴槽中孵育8小时。待反应结束后用分子量为7000的透析袋对反应液透析纯化48小时，得到脲酶-金纳米团簇荧光材料水溶液。将所得溶液置于0.2~2mol/l氯化钠溶液中孵育30分钟后，脲酶-金纳米团簇的相对荧光强度均保持在90%以上（图12）。

实例10：

将浓度为5ml浓度为1mol/l的naoh溶液与20ml浓度为10mmol/l氯金酸依次加入到20ml浓度为50mg/ml新鲜配制的脲酶溶液中，混匀后置于37℃恒温水浴槽中孵育8小时。待反应结束后用分子量为7000的透析袋对反应液透析纯化48小时，得到脲酶-金纳米团簇荧光材料水溶液。将所得溶液置于10%人血清溶液中孵育30分钟后，脲酶-金纳米团簇的相对荧光强度为90.0%（图13）。