本发明属于生物技术领域，具体涉及一种量子点纳米复合物、其制备方法及应用。
背景技术
外泌体(exosomes,exo)是由细胞分泌的直径为30-150nm的囊泡，承担细胞间通讯和物质转运等职能。由于外泌体携带蛋白质和rna等，并具有低免疫原性，其用作疾病标志物和靶向药物载体的研究成为热点。研究表明，干细胞来源的外泌体具有修复的功能，特别是在退行性疾病和神经炎性疾病中。此外，与外泌体相关的特异性标记物可用于监测癌症。为进一步将干细胞源外泌体用于临床治疗，研究者需全面掌握其代谢情况。对于外泌体的研究仍处于早期阶段，受纳米尺寸的限制且不同细胞类型分泌的外泌体其体内代谢路径势必不同。标记外泌体探究其在体内的代谢情况，成为重大挑战。
量子点(quantumdots,qds)是一种半导体荧光纳米晶体，由iib-via或iiia-va族元素组成，粒径小于10nm，具有良好的光化学稳定性及生物相容性，且激发光谱宽，发射光谱窄，荧光寿命长，不易猝灭等特点。量子点作为荧光标记物，具有较高的灵敏度，在细胞示踪和生物检测方面具有重要的应用价值，目前广泛应用于生物标记、生物传感和生物成像的研究中。因此，设计出稳定，通用且多样化的量子点纳米探针对于量子点在生物医学中的应用有重要的价值。
适配体(aptamer,apt)是人工合成的单链dna或rna序列，通过分子内折叠，能够以高亲和力特异性地结合目标蛋白。具有易合成，易修饰，易扩增，分子量小，稳定性强的特点，因而在分子生物学领域得到了广泛的应用。适配体具有广泛的配体范围，可以通过selex系统筛选出来。随着技术的发展，越来越多外泌体表面特定蛋白相对应的适配体将被发现，适配体为标记外泌体的应用带来了新的方向。
因此利用量子点的荧光信号搭载适配体特异性结合外泌体表面蛋白的特性，针对干细胞源外泌体进行代谢路径的研究，实现外泌体的示踪，对外泌体应用于临床疾病诊断及治疗具有重大意义。
技术实现要素：
为了解决上述问题，本发明采用的技术方法如下：
首先，本发明制备一种量子点纳米复合物，即量子点-适配体纳米复合物(特异性的量子点适配体荧光探针，apt/qds)，在量子点探针表面化学偶联外泌体膜的生物识别因子cd63适配体用于特异性标记。
所述量子点适配体荧光探针制备方法，具体步骤如下：
将带有氨基基团的水溶性量子点通过交联剂磺基-smcc[(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯，钠盐]sulfo-smcc与巯基修饰的序列caccccacctcgctcccgtgacactaatgcta的cd63适配体进行偶联。
本发明的另一方面在于，公开上文所述量子点纳米复合物的制备方法，具体步骤如下：
(1)避光条件下，取浓度为8～10μm的氨基水溶性量子点，再加入等体积的浓度为4～5μm的sulfo-smcc，室温摇床反应1～2h；
(2)取步骤(1)所得的反应液在10000～12000rpm离心除去沉淀；取上清加入到脱盐柱nap-5columns中，用pbs洗脱，收集有荧光的溶液加入至1odcd63适配体中，避光震荡2～4h后，加入半胱氨酸封闭；
(3)将上述反应产物经50k超滤管amiconultra-0.5device(50k)14000～16000g离心5～10min，收集沉淀；重悬得到量子点适配体探针。
本发明的再一方面为，公开一种量子点纳米复合物的应用，进一步的，所述应用为本发明的量子点纳米复合物在干细胞源外泌体标记与示踪方面的应用。
进一步的，所述应用为量子点纳米复合物在干细胞源外泌体的代谢路径、外泌体载药体内研究及临床研究中的应用。该量子点纳米复合物能标记脐带间充质干细胞源外泌体，利用先进的共聚焦显微镜成像技术示踪干细胞来源的外泌体与代谢器官(肝、肺、肾)的细胞相互作用的情况，验证了脐带间充质干细胞源外泌体进入三种代谢器官细胞的效率，结果表明，exo-apt/qds与细胞共同孵育5h后，进入三种细胞系的效率依次为qsg-7701(人正常肝细胞)>beas-2b(人正常肺上皮细胞)>hkc(人胚肾上皮细胞)。为进一步研究外泌体代谢路径、外泌体载药等体内及临床研究提供技术支持。
上文所述利用共聚焦显微镜成像技术示踪外泌体，所采用的检测条件为：选择10μl体积的apt/qds纳米探针与5μg外泌体(即2μl:1μg)为成像最优比例。干细胞源外泌体与代谢器官细胞共孵育时间为5h，成像比例为每20～40μg外泌体对应(2～4)*104个/ml细胞。
进一步的，对于上文所述利用共聚焦显微镜成像技术示踪外泌体的方法中，所采用的干细胞源外泌体与代谢器官细胞成像比例为每20μg外泌体对应2*104个/ml细胞。
本发明的有益效果
本发明中，为实现外泌体的特异性示踪，在量子点表面偶联能够识别外泌体膜cd63的适配体，使之具备不受组织深度限制的高分辨率、高对比度和高灵敏度的快速成像能力。
本发明中，用纳米探针标记外泌体，分别示踪其与代谢器官(肝、肺、肾)的细胞相互作用的情况，借助量子点的荧光信号，实现外泌体的示踪，便于研究外泌体在机体内的路径。
本发明中，以外泌体为技术平台，对apt/qds纳米探针标记的外泌体代谢路径进行体外研究，为后续外泌体载药等体内及临床研究打下基础。
附图说明
图1a为apt/qds葡聚糖凝胶电泳，条带1和条带2均为qds，条带3为apt/qds，条带4和条带5为dnamarker。b为405nm激发时apt/fitc/qds的发射光谱图；
图2a为干细胞源外泌体原子力显微镜表征结果图；b为干细胞源外泌体透射电镜表征结果图；c为干细胞源外泌体westernblot表征结果图；d为干细胞源外泌体nanosight表征结果图；e为干细胞源外泌体westernblot表征结果图。
图3不同孵育剂量量子点纳米复合物示踪外泌体与肝细胞共孵育4小时共聚焦显微镜图；
图4量子点纳米复合物示踪外泌体与代谢器官细胞作用共聚焦显微镜图。
具体实施方式
下述非限定性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1
量子点适配体荧光探针制备：
将带有氨基基团的水溶性量子点通过交联剂磺基-smcc[(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯，钠盐]sulfo-smcc与巯基修饰的序列如下的cd63适配体进行偶联：caccccacctcgctcccgtgacactaatgcta。
具体偶联步骤如下：
(1)实验进行前将sulfo-smcc与cd63适配体解冻。
(2)将氨基水溶性量子点避光条件下取88μl(8μm)加入到反应器中，加入等体积4μmsulfo-smcc，避光条件下室温快速摇床反应1h。
(3)将上述反应液10000rpm离心5min，除去沉淀。
(4)取上清加入到脱盐柱nap-5columns中，用10mlpbs洗脱，收集有荧光的部分，约800μl。
(5)将上述收集的溶液加入至1odcd63适配体中，避光摇床2h。
(6)摇床结束后加入8μl半胱氨酸封闭。
(7)将反应物经50k超滤管amiconultra-0.5device(50k)14000g离心5min，收集内管浓缩液。
(8)100μlpbs重悬内管浓缩液得到量子点适配体探针，4℃保存。
对制备的量子点适配体荧光探针进行表征鉴定。取apt/qds纳米探针溶液3μl，qds3μl作为对照，上样。琼脂糖凝胶电泳20min，电压100v。荧光光谱仪(hitachif-7000)记录带有荧光fitc标记的apt与qds制备的纳米探针。样本量为200μl，荧光测量的条件如下：激发波长为405nm，发射波长扫描范围是200-800nm，450v电压和1200nmmin-1扫描速率。获得荧光光谱扫描图像。
提取脐带间充质干细胞源外泌体
人脐带间充质干细胞uc-mscs在无血清培养基中培养48h，收集培养基上清液240ml，4℃条件下分别以2000g(30min)和20000g(60min)连续离心去除细胞和碎片，上清液通过0.22μm过滤器过滤，通过两次连续100000g(60min)超速离心机收集外泌体絮状沉淀并重悬于磷酸盐缓冲液(pbs)中，-80℃低温冰箱保存。使用bradford测定法定量评估蛋白质浓度并用pbs调整至1mg/ml。
对外泌体进行表征鉴定。用原子力显微镜afm对外泌体的形态进行观察，将外泌体水溶液超声30min后，取一滴样品置于载玻片上，并在氩气流下干燥，获取原子力显微镜测量图像。使用nanoscopeanalysis软件对获得的图像进行分析处理。将外泌体悬液10μl超声20min，用等体积4％多聚甲醛室温固定30min，滴于铜网上，磷钨酸染色5min后多余的液体被吸走并干燥，透射电子显微镜采集并观察外泌体的大小形态以。外泌体的大小和囊泡数目分别使用纳米颗粒分析仪qnano(izon)对其追踪分析进行评估。外泌体稀释至200μl，超声30min后测量外泌体的浓度及尺寸。使用bca蛋白定量试剂盒对提纯的外泌体进行蛋白定量。将样本转移到pvdf膜上。pvdf膜在含有0.1％tween20的tris缓冲盐水(tbs)中5％脱脂奶粉室温封闭1.5-2min。用anti-cd9antibody以及anti-cd63antibody一抗1:1000稀释4℃过夜(缓慢摇床)，tbst中清洗3次，室温下用二抗进行标记，免疫化学检测使用全自动发光图像仪采集图像。
探索apt/qds与exo最优比例
1×104/ml个qsg7701肝细胞接种到48孔细胞培养板上并孵育24h。不同剂量0.5、2.5、10、20μl量子点适配体荧光探针标记5μg外泌体，37℃，避光4h。超速离心100000g1h提纯后pbs重悬沉淀，将其与接种后的肝细胞qsg770137℃避光条件下共孵育5h,结束后pbs冲洗3次，每次5min。4％多聚甲醛固定30min，pbs冲洗3次。dapi染色细胞核，染色20min，pbs洗涤3次后用激光共聚焦显微镜观察采集图像，激光为405nm。探索荧光探针标记外泌体的最优比例。结果显示10μl体积的apt/qds与5μg外泌体为成像最优比例
exo-apt/qds与代谢细胞作用
选取10μl量子点适配体荧光探针标记5μg外泌体，4h共孵育后超速离心100000g1h进行提纯，pbs重悬沉淀与三种代谢细胞肝细胞qsg7701、肾细胞hkc、肺细胞beas-2b共孵育5h，激光共聚焦显微镜观察，激发波长405nm，探索三种细胞代谢外泌体的程度。exo-apt/qds与细胞共同孵育5h后，进入三种代谢细胞系的效率依次为：qsg-7701>beas-2b>hkc。
对于任何熟悉本领域的技术人员而言，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的技术内容对本发明技术方案作出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均应仍属于本发明技术方案保护的范围内。